耐輻射球菌pprI基因在酵母菌中的表達(dá)及其蛋白抗放作用與機(jī)理的研究.pdf

1、目的:
　　Ppr1基因(NCBI:DR-0167)是存在于耐輻射球菌(Deinococcus radiodurans, DR)R1中的大小約970bp的基因,是耐輻射球菌所特有的負(fù)責(zé)輻射抗性的一個(gè)開關(guān)基因。它可以顯著調(diào)節(jié)輻射修復(fù)基因recA和pprA等基因的表達(dá),并能增強(qiáng)細(xì)胞清除自由基的能力。ppr1基因介導(dǎo)的DNA修復(fù)和保護(hù)作用,是耐輻射球菌在強(qiáng)輻射作用下仍能保持生存和基因組完整性的重要原因之一。ppr1基因轉(zhuǎn)化模式生物大腸桿

2、菌后,不僅可以增強(qiáng)大腸桿菌的輻射抗性,還能提高大腸桿菌的抗逆性及耐鹽能力。
　　Ppr1基因的抗放作用是通過其功能蛋白實(shí)現(xiàn)的。由于pprI是在原核生物耐輻射球菌中所獨(dú)有的基因,欲研究其蛋白在真核生物中,特別是對(duì)哺乳動(dòng)物及細(xì)胞的作用,須獲得真核表達(dá)系統(tǒng)翻譯轉(zhuǎn)錄的具有生物活性的蛋白質(zhì)。將pprI原核基因轉(zhuǎn)入真核生物中穩(wěn)定高效表達(dá),獲得具有生物活性的PprI蛋白,迄今為止在國內(nèi)外尚未見有關(guān)報(bào)道。真核表達(dá)的PprI蛋白提純后應(yīng)用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

3、,在國內(nèi)外也是空白。本課題旨在將ppr1基因轉(zhuǎn)化酵母菌,將目的蛋白提純并應(yīng)用于受照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,研究PprI蛋白對(duì)酵母菌及哺乳動(dòng)物小鼠的抗放作用于機(jī)理。為進(jìn)一步用于臨床輻射損傷防治提供有價(jià)值的理論和實(shí)驗(yàn)資料。
　　材料與方法:
　　本課題構(gòu)建了pprI基因的畢赤酵母表達(dá)載體pHBM-PprI,并成功轉(zhuǎn)化進(jìn)入GS115酵母菌株。應(yīng)用質(zhì)譜分析PprI蛋白在酵母菌中的分泌表達(dá)。對(duì)轉(zhuǎn)化菌株及未轉(zhuǎn)化菌株進(jìn)行輻射抗性試驗(yàn),檢測酵母菌中抗氧化

4、酶SOD、CAT活性,應(yīng)用Western檢測酵母菌中輻射修復(fù)蛋白R(shí)ad24和Rad51的表達(dá)量,并進(jìn)行半定量分析。
　　為了研究PprI蛋白對(duì)哺乳動(dòng)物及細(xì)胞的抗放作用,本課題構(gòu)建了含有(His)6以及TAT標(biāo)簽的酵母表達(dá)載體pPICZαA-PprI質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化酵母菌株獲得分泌型表達(dá),通過鎳柱層析提純目的蛋白。
　　提純后的PprI蛋白應(yīng)用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。首先觀察了肌肉和腹腔注射對(duì)受照小鼠輻射后死亡率的影響。該實(shí)驗(yàn)不僅觀察了兩種注射

5、方式,還分組觀察了注射時(shí)間與輻射時(shí)間前后及時(shí)間的差異。其次,觀察了受照小鼠外周血細(xì)胞數(shù)量及骨髓細(xì)胞增殖能力的變化。接著分別檢測了受照小鼠器官、組織中SOD、CAT活性變化,以及Rad17和Rad51的表達(dá)。最后,應(yīng)用人體外周血體外培養(yǎng),觀察PprI蛋白對(duì)受照淋巴細(xì)胞染色體畸變率的影響。
　　結(jié)果:
　　1.本課題根據(jù)畢赤酵母密碼子偏好性,重新合成pprI基因,構(gòu)建了畢赤pHBM-pprI質(zhì)粒表達(dá)載體,并轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115

6、菌株。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)譜分析,證實(shí)耐輻射球菌的PprI蛋白在畢赤酵母GS115菌株成功獲得分泌型表達(dá)。
　　2.DR菌pprI基因在酵母菌中異位表達(dá),提高了酵母菌的輻射抗性,與對(duì)照組比較,pprI基因轉(zhuǎn)染在酵母菌克隆形成率顯著提高(P<0.05); Rad24和Rad51表達(dá)量與SOD、CAT活性增高(P<0.05)。
　　3.以本室保存的pCMV-HA-pprI為模板構(gòu)建的pPICZαA–pprI真核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化畢赤酵母X3

7、3菌株,經(jīng)SDS-PAGE和His-tag的抗體做Western blotting鑒定,顯示PprI融合蛋白在酵母菌株中成功分泌表達(dá)。轉(zhuǎn)化后的菌株發(fā)酵上清液,經(jīng)鎳柱層析提純,獲得了濃度為0.34mg/ml的目的蛋白。
　　4.在輻射前后1h內(nèi),給予小鼠肌肉注射和腹腔注射PprI蛋白可以使小鼠死亡率從對(duì)照組的50％降低到20％。PprI蛋白腹腔注射,受照小鼠外周血紅細(xì)胞、血小板數(shù)量增加,淋巴細(xì)胞百分比增加,小鼠骨髓細(xì)胞克隆形成率較對(duì)

8、照組明顯著提高(P<0.05)。
　　5.PprI蛋白輔助培養(yǎng)對(duì)人離體外周血淋巴細(xì)胞染色體畸變無顯著影響。
　　結(jié)論:
　　1.本課題組成功的地合成了新的耐輻射球菌pprI基因編碼序列,首次構(gòu)建了pPICZαA–pprI真核表達(dá)載體,在酵母菌中獲得異位高效表達(dá)和純化
　　2.轉(zhuǎn)pprI基因酵母菌的輻射抗性顯著增加。轉(zhuǎn)基因酵母菌抗氧化能力及輻射修復(fù)蛋白表達(dá)增加可能是其輻射抗性增加的分子機(jī)理之一。
　　3.在小

9、鼠受照前后注射PprI蛋白,可提高受照小鼠的抗輻射能力,主要表現(xiàn)為小鼠死亡率明顯降低;骨髓細(xì)胞克隆形成率提高;小鼠外周血紅細(xì)胞、血小板計(jì)數(shù)和血淋巴細(xì)胞百分率增加。
　　4.PprI蛋白抗放作用機(jī)理的研究發(fā)現(xiàn),PprI蛋白可提高受照小鼠紅細(xì)胞、血漿、骨髓細(xì)胞、肝臟中的CAT、SOD活性,但對(duì)心肌細(xì)胞、腎臟組織中的CAT、SOD活性無明顯影響;并且增加受照小鼠肝臟、腎臟、脾臟、心臟組織中Rad17、Rad51蛋白的表達(dá)量,使其表達(dá)時(shí)間