系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者糖皮質激素沖擊治療前后TCRβ鏈CDR3受體庫的特征和變化分析.pdf

1、目的：
　　采用Illumina Solexa高通量測序技術，探討系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus，SLE）患者大劑量糖皮質激素沖擊治療前后三個不同時間點（治療前、治療后第一個月、治療后第三個月），外周血T細胞TCRβ鏈CDR3受體庫的特征和變化。
　　方法：
　　1從遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院腎病風濕科住院患者中，根據美國風濕病學會2011年修訂的SLE診斷標準和SLEDAI活動指數評

2、分標準，遵從患者知情同意原則下，篩選2名SLE活動期志愿患者。
　　22例SLE活動期的志愿患者：Patient1（P1）；Patient2（P2），在糖皮質激素沖擊治療前、治療后第一個月和治療后第三個月時，每次采集外周血量5ml，同時檢測患者外周血白細胞數量及抗核抗體譜水平。
　　3分離各外周血液樣本中單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC），分別提取各樣本的總 DNA。各

3、樣本序號命名為：P1-0：患者1治療前樣本；P1-1：患者1治療后一個月樣本；P1-3：患者1治療后三個月樣本；P2-0：患者2治療前樣本；P2-1：患者2治療后一個月樣本；P2-3：患者2治療后三個月樣本。
　　4按照人T細胞TCRβ鏈CDR3受體庫建庫原理，采用多重PCR技術對各樣本的總DNA CDR3區(qū)擴增建庫，采用Illumina Solexa高通量測序技術分別測定這三個不同時間點的TCRβ鏈 CDR3受體庫基因序列（建庫

4、和測序由美國華盛頓醫(yī)學院Adaptive Biotechnologies immunoSEQ完成）。
　　5 T細胞TCRβ鏈 CDR3受體庫的組成和特征分析：測序后所得各個樣本的序列轉化為FASTA格式（又稱Pearson格式，為核苷酸序列或氨基酸序列的格式），提交至IMGT/HighV-QUEST在線軟件，對上傳后得IMGT summary文件，分析各樣本T細胞TCRβ鏈 CDR3受體庫的克隆多樣性，TRBV、TRBJ基因家族

5、分布及CDR3區(qū)的特征變化等。
　　結果：
　　12例SLE志愿患者三個時間點血清抗核抗體水平：
　　P1-0：抗ds-DNA抗體(+++)、抗RNP/SM抗體（++）、抗SSA抗體（++）；
　　P1-1：抗ds-DNA抗體(+++)、抗RNP/SM抗體（++）、抗SSA抗體（++）；
　　P1-3：抗ds-DNA抗體(+++)、抗RNP/SM抗體（+++）、抗SSA抗體（+++）；
　　P2-0：

6、抗ds-DNA抗體(+)、抗RNP/SM抗體（-）、抗SSA抗體（-）；
　　P2-1：抗ds-DNA抗體(+++)、抗RNP/SM抗體（++）、抗SSA抗體（+）；
　　P2-3：抗ds-DNA抗體(++)、抗RNP/SM抗體（+++）、抗SSA抗體（-）。
　　2例SLE志愿患者三個時間點白細胞數目：
　　P1-0：WBC7.3×109個/L、P1-1：WBC4.7×109個/L、P1-3：WBC7.1×10

7、9個/L；P2-0：WBC5.8×109個/L、P2-1：WBC3.6×109個/L、P2-3：WBC7.9×109個/L。22例SLE志愿患者三個時間點，PBMC的總DNA，在瓊脂糖凝膠電泳圖上，每個樣本 DNA預測位置均出現(xiàn)清晰的條帶。樣本經美國華盛頓醫(yī)學院 Adaptive Biotechnologies ImmunoSEQ檢測，六個樣品各個總DNA量達2ug以上，符合建庫和Illumina Solexa高通量測序要求。
　

8、　3六個樣本 T細胞 TCRβ鏈 CDR3高通量測序原始序列數：原始序列總數/總Productive序列數/獨特的CDR3序列數，分別是：P1-0：884760條/731401條/34130條； P1-1：1539362條/1268445條/38849條； P1-3：1654320條/1371381條/23553條；P2-0：1219887條/994323條/24527條；P2-1：811161條/660616條/22632條；P2-3

9、：979612條/794783條/32190條。
　　4六個樣本TCR CDR3受體庫克隆多樣性變化：
　　4.1六個樣本的反辛普森指數，數值分別是P1-0：393.0113；P1-1：423.7155；P1-3：346.8453；P2-0：1725.220656；P2-1：159.3978332；P2-3：495.7108618。
　　4.2六個樣本中出現(xiàn)高頻增殖克隆(Highly expanded clones，H

10、EC）為：P1-0：0.0440％；P1-1：0.0440%；P1-3：0.0637%；P2-0：0.0082%；P2-1：0.0442%；P2-3：0.0093%。
　　4.3 P1和P2在治療前后出現(xiàn)的CDR3區(qū)共同的高頻克隆增值序列：P1治療前后均存在且對應不同的TRBV/TRBJ基因家族序列：CASSRTVSNQPQHF； CASSYNHEQYF；CASSVVGNTEAFF。P2治療前后均存在且對應不同的TRBV/TRBJ

11、基因家族序列：CASSPRTSYEQYF。兩例SLE志愿患者在治療前后三個時間點的高頻克隆增值序列中都存在共同的E-Q-Y氨基酸基序。
　　5六個樣本TCR CDR3受體庫克隆序列分析結果：
　　5.1六個樣本優(yōu)勢取用的TRBV家族：
　　P1在治療前后均是優(yōu)勢取用的家族有TRBV28、TRBV19、TRBV2，治療前、后沒有發(fā)現(xiàn)取用丟失和新出現(xiàn)的家族。P2在治療前后均是優(yōu)勢取用的家族有TRBV2、TRBV28、TRB

12、V20-1，而TRBV12-4、TRBV7-1為治療后第一個月新出現(xiàn)家族。兩例志愿患者三個時間點均優(yōu)勢取用TRBV28、TRBV2基因家族。
　　5.2六個樣本優(yōu)勢取用的TRBJ家族：
　　在治療前后均是優(yōu)勢取用的家族有TRBJ2-7、TRBJ1-1、TRBJ1-5、TRBJ1-2、TRBJ2-1。P2在治療前后均是優(yōu)勢取用的家族有TRBJ2-7、TRBJ1-1、TRBJ2-1、TRBJ1-2、TRBJ2-3。兩例SLE志愿

13、者三個時間點T細胞受體庫均優(yōu)勢取用TRBJ2-7、TRBJ1-1、TRBJ2-1、TRBJ1-2基因家族，都無TRBJ基因家族的取用丟失現(xiàn)象。
　　5.3六個樣本優(yōu)勢取用的TRBV-TRBJ家族配對：
　　P1治療前后均存在優(yōu)勢配對的是TRBV28-TRBJ1-5、TRBV28-TRBJ2-7、TRBV6-2-TRBJ2-7。P2治療前后均存在優(yōu)勢配對的是TRBV2-TRBJ2-7、TRBV28-TRBJ2-7。P1與P2治

14、療前后均有高頻配對家族TRBV28-TRBJ2-7。
　　5.42例SLE志愿患者T細胞CDR3長度分布：P1在治療前后的CDR3長度均是以12或13個AA長度為主的鐘形分布。P2治療前和治療后一個月是以13個AA為主，在治療后一個月出現(xiàn)以11個AA的異常高取用，治療后三個月以11個AA為主，呈鐘形分布。5.52例SLE志愿患者治療前后樣本的CDR3區(qū)氨基酸均高頻取用以絲氨酸（S）為代表的羥基類、極性中性（親水性）氨基酸。

15、　　5.62例SLE志愿患者治療前后CDR3區(qū)的重疊結果：P1治療前后均重疊的序列數為1466條，P2治療前后均重疊的序列數為559條。
　　結論：
　　1在血清學檢測水平，兩例SLE活動期患者治療后的各項臨床檢驗學的指標，出現(xiàn)好轉傾向，但是2例SLE志愿患者之間，每個SLE志愿患者不同時期的各T細胞TCRβ鏈CDR3受體庫的多樣性表現(xiàn)不一致，提示可能與自身反應性T細胞的應答程度相關。
　　2本實驗通過對SLE志愿患者

16、治療前、后TCRβ鏈CDR3受體庫中TRBV、TRBJ基因家族優(yōu)勢取用和配對，CDR3區(qū)長度分布、氨基酸取用和重疊率的組成特征及動態(tài)變化對比分析，獲得兩例SLE志愿患者治療前后三個不同時間點外周血TCRβ鏈CDR3庫特征和變化的數據，提示其與SLE患者對大劑量糖皮質激素沖擊治療的免疫應答存在一定相關性，可為治療前、后患者T細胞應答狀態(tài)和水平提供評估基礎數據。
　　3實驗從2例SLE志愿患者篩選到的高頻克隆增殖TCRβ鏈 CDR3氨