轉重組人IL-1Ra和TGF-β1基因治療兔骨性關節(jié)炎的實驗研究.pdf

1、本研究的目的:是評估通過在脂質體介導下聯(lián)合應用IL-1Ra和TGF-β1基因防止關節(jié)軟骨退變的能力。我們假設聯(lián)合應用抑制性細胞因子和促合成代謝因子能夠防止軟骨退變和促進軟骨基質的合成。 第一部分重組人IL-1Ra和TGF-β1質粒的構建 目的：擴增、純化重組人基因pEGFP-C1-IL-1Ra和pEGFP-C1-TGF-β1，并進行酶切鑒定，為基因轉染提供目的基因。 方法：從人胎肝細胞中提取總RNA，RT-PCR

2、法逆轉錄合成cDNA，再以cDNA為模板，PCR擴增IL-1Ra和TGF-β1目的基因片段，克隆進pGEM-T Easy Vector載體并測序。通過Bgl II和XhoI進行雙酶切，酶切片斷通過T4DNA連接酶連接到pEGFP-C1載體上，構建pEGFP-C1-IL-1Ra和pEGFP-C1-TGF-β1表達質粒。制備DH5a感受態(tài)，進行質粒轉化，鋪板篩選并提取陽性克隆酶切鑒定。 結論：成功克隆和建立重組人pEGFP-C1-I

3、L-1RαpEGFP-C1-TGF-β1真核表達質粒，為進一步OA基因治療研究奠定了基礎。 第二部分重組人IL-1Ra和TGF-β1基因轉染軟骨細胞后的表達 目的：探討重組人IL-1Ra和TGF-β1雙基因轉染兔軟骨細胞后的表達及對細胞生物學性狀的影響，為OA基因治療中目的基因的選擇提供參考。 方法：無菌條件下取新西蘭白兔髖膝關節(jié)軟骨，經消化分離，軟骨細胞以1.5×105／ml濃度培養(yǎng)于6孔培養(yǎng)板。軟骨細胞分為4

4、組，即轉染IL-1Ra(4μg)組、轉染TGF-β1(4μg)組、轉染IL-1Ra(4μg)+TGF-βl(4μg)雙基因組、未轉染組。上述轉染組均以Lipofectamine TM 2000 Reagent脂質體為轉染媒介。通過倒置熒光顯微鏡觀察轉基因的表達和實時熒光定量PCR檢測其表達，MTT法檢測IL-1Ra和TGF-v1基因轉染對軟骨細胞生物學性狀的影響。 結論：IL-1Ra和TGF-β1雙基因轉染軟骨細胞可以獲得表達，

5、為OA的基因治療提供研究基礎。 第三部分轉IL-1Ra和TGF-β1基因治療兔骨性關節(jié)炎的體外實驗 研究目的：觀察重組人IL-1Ra和TGF-β1雙基因在體外對兔OA軟骨退變的治療效果，為今后OA的基因治療提供依據。 方法：取新西蘭白兔關節(jié)軟骨，經消化分離，軟骨細胞以1.5×105／ml濃度培養(yǎng)于6孔培養(yǎng)板。軟骨細胞分為5組，轉染IL-1Ra組、轉染TGF-β1組、轉染IL-1Ra+TGF-β1雙基因組、未轉染組

6、、空白組，轉染方法同第二部分。上述轉染組均以Lipofectamine TM 2000 Reagent脂質體為轉染媒介。各組加入軟骨塊，除空白組外，其余各組均加入20ng IL-1β，通過倒置熒光顯微鏡觀察轉基因的表達。分別于2d、4d、6d后每組各取4孔1.5ml培養(yǎng)基，ELISA法檢測TGF-β1和IL-1Ra的含量，RIA法檢測IL-1β和TNF-α的含量。收集第6d軟骨塊HE染色、阿爾新藍染色及II型膠原免疫組化檢測等組織學觀察

7、。 結論：轉基因組均對損傷軟骨有修復作用。轉染IL-1Ra+TGF-β1雙基因組的治療效果優(yōu)于單基因。聯(lián)合應用IL-1Ra和TGF-β1能抑制軟骨的退變和促進軟骨的修復，為體外OA的基因治療提供良好的實驗基礎。 第四部分轉IL-1Ra和TGF-β1基因治療兔骨性關節(jié)炎的體內實驗 研究目的：觀察重組人IL-1Ra和TGF-β1雙基因在兔體內對OA軟骨退變的治療效果，為今后OA的基因治療提供依據。 方法：采用

8、切斷并切除內側副韌帶0.5cm及切除內側半月板的方法，將16只新西蘭白兔的雙膝關節(jié)制成早期OA模型，術后第5d，分為4組向關節(jié)腔注射，A：空白對照組(NS 0.5ml)，B：IL-1Ra 100μg+脂質體50μl+NS 0.5ml，C：TGF-β100μg+脂質體50μl+NS 0.5ml，D：IL-1Ra100μg+TGF-β1100μg+脂質體100μl+NS 1ml。兩天后再注射一次。注射后第7d用無菌NS灌沈關節(jié)腔，抽取關節(jié)灌