廣西眼鏡蛇CT和PLA2基因的真核表達(dá)和鎮(zhèn)痛活性檢測.pdf

1、眼鏡蛇神經(jīng)毒素(Neurotoxin，NT)是一種潛在的麻醉劑和解毒藥物，在醫(yī)用研究領(lǐng)域發(fā)揮巨大的作用。但由于蛇毒的產(chǎn)量小且分離難度大，限制了蛇毒在醫(yī)用上的應(yīng)用范圍。因此，本研究旨在利用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在體外獲得具有鎮(zhèn)痛活性的廣西眼鏡蛇蛇毒蛋白（Cobortoxin，CT）和凝脂酶A2(Phospholipase A2，PLA2)。
　　 分別利用分段克隆和反轉(zhuǎn)錄PCR的方法克隆了廣西眼鏡蛇CT和PLA2基因的編碼序列。然后

2、將攜帶和不攜帶His標(biāo)簽的CT和PLA2插入桿狀病毒穿梭載體pFastBacTM Dual啟動(dòng)子PH和p10的下游，獲得不攜帶His標(biāo)簽的重組質(zhì)粒:pD-CT、pD-PLA2、pD-CT-PLA2和攜帶His標(biāo)簽的重組質(zhì)粒:pD-H-CT、pD-H-PLA2、pD-HCT-HPLA2。將6種穿梭載體轉(zhuǎn)入DH10Bac中，用抗生素（慶大霉素、卡那霉素和四環(huán)素）和藍(lán)白斑篩選、PCR和測序鑒定，得到攜帶目的基因的6種昆蟲病毒表達(dá)載體:BM-C

3、T、BM-PLA2、BM-CT-PLA2、BM-HCT、BM-HPLA2、BM-HCT-HPLA2。
　　 利用轉(zhuǎn)染試劑CellfectinⅡ?qū)y帶目的基因的6種昆蟲病毒表達(dá)載體和空載體轉(zhuǎn)入Sf9昆蟲細(xì)胞，經(jīng)PCR鑒定，成功獲得了7種病毒顆粒。用病毒顆粒感染細(xì)胞，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，在細(xì)胞裂解上清中檢測到特異目的條帶，提示目的蛋白是可溶的。
　　 分別利用電洗脫和Ni柱親和純化的方法成功從