腎移植受者移植前免疫狀態(tài)及其與移植腎功能關系研究.pdf

1、第一部分腎移植受者移植前外周血白細胞分型與腎移植預后關系
　　目的:腎移植受者免疫狀態(tài)的監(jiān)測對評估其罹患排斥反應、腫瘤、感染或免疫抑制劑藥物中毒風險的高低十分重要。在腎移植臨床工作和科學研究的實踐中，對腎移植受者免疫狀態(tài)尤其是術后相關指標的系統(tǒng)評估方法正逐漸完善。群體反應性抗體的檢測已經(jīng)應用于移植前受者的風險評估，而探尋其他移植前免疫檢測指標也逐漸得到了學界的共識。腎移植受者在移植前淋巴細胞功能紊亂，表現(xiàn)為T細胞數(shù)顯著減少，CD4

2、+/CD8+比例降低，Th1/Th2比例升高，同時伴有初始T細胞和中央記憶T細胞細胞減少，CD4+CD28-T細胞比例增加。此種狀態(tài)導致T細胞免疫的減弱，從而增加術后移植腎功能延遲恢復或急性排斥反應的發(fā)生率，影響腎移植預后。本部分旨在研究腎移植受者移植前白細胞及淋巴細胞分型與術后移植物功能恢復情況的關系，并探討其意義。
　　方法:收集2012年12月至2013年12月于復旦大學附屬中山醫(yī)院泌尿外科腎移植中心行同種異體腎移植術尿毒癥

3、患者的相關資料，檢測相關臨床生化指標，采用流式細胞術檢測淋巴細胞分型。根據(jù)腎移植受者術后6個月肌酐水平三分位數(shù)將患者分為術后6個月肌酐較低組(Group A: Cr≤95μmol/L)、肌酐中等組（Group B:95＜Cr≤139μmol/L）、肌酐較高組(GroupC:Cr＞139μmol/L)，并采用單因素方差分析方法、單因素線性分析及多因素Logistic回歸分析比較移植前白細胞、淋巴細胞、CD3+T細胞、CD3+CD4+T細胞

4、、CD3+CD8+T細胞、B細胞、NK細胞數(shù)及CD3+/CD4+比值與術后6個月肌酐的關系。
　　結果:術后6個月肌酐較低組移植前白細胞總數(shù)顯著低于肌酐較高組（5.36±0.67vs.7.3±1.32，p=0.010），移植前淋巴細胞數(shù)顯著低于肌酐較高組（0.93±0.46vs.1.86±0.47，p=0.005），移植前CD3+T細胞數(shù)顯著低于肌酐中等組及肌酐較高組（vs.Group B:61.60±38.35 vs.122.7

5、6±61.98，p=0.027; vs.Group C:61.60±38.35 vs132.99±43.94，p=0.012），移植前CD3+CD4+T細胞數(shù)顯著低于肌酐中等組及肌酐較高組（vs.Group B:36.84±20.86 vs.70.86±29.39，p=0.013;vs.Goup C:36.84±20.86 vs.65.66±20.10,p=0.031），移植前CD3+CD8+T細胞數(shù)顯著低于肌酐較高組(22.33±17

6、.53 vs.59.98±25.64,p=0.010)。移植前CD19+B細胞數(shù)、NK細胞數(shù)及CD3+/CD4+比值在各組間無顯著性差異。
　　單因素線性分析顯示移植前白細胞總數(shù)、淋巴細胞數(shù)、CD3+T細胞數(shù)、CD3+CD4+T細胞數(shù)、CD3+CD8+T細胞數(shù)與術后6個月肌酐值顯著正相關（p均＜0.05），移植前CD19+B細胞數(shù)、NK細胞數(shù)及CD3+/CD4+比值與術后6個月肌酐值無顯著相關性。
　　進一步術后6個月肌酐較

7、低組、肌酐中等組和肌酐較高組中對年齡、性別、高血壓、糖尿病、供腎類型、術前肌酐進行多因素Logistic回歸分析，顯示移植前白細胞總數(shù)在不同分組間不存在顯著性差異，而移植前淋巴細胞數(shù)、CD3+T細胞數(shù)、CD3+CD4+T細胞數(shù)、CD3+CD8+T細胞數(shù)在不同分組間存在顯著性差異（p均＜0.001）。
　　結論:腎移植受者移植前外周血白細胞、淋巴細胞及其亞型水平與術后腎功能水平密切相關。移植前淋巴細胞數(shù)、CD3+T細胞數(shù)、CD3+C

8、D4+T細胞數(shù)、CD3+CD8+T細胞數(shù)較高的腎移植受者，術后6個月血清肌酐趨于維持在較高水平。因此，腎移植受者移植前免疫功能狀態(tài)可能影響移植腎預后，該結論尚需進一步的研究證實。
　　第二部分ESRD患者外周血白細胞分類變化及淋巴細胞分型的相關因素分析
　　目的:腎移植受者在移植前ESRD期間因氧化應激、尿毒癥毒素潴留、代謝紊亂等，存在免疫激活與免疫抑制并存的狀態(tài)，對各種免疫細胞功能有廣泛的影響，這種免疫功能紊亂可能影響移植

9、腎短期及長期預后。本研究旨在比較ESRD患者與健康志愿者不同白細胞分類水平，分析ESRD患者淋巴細胞亞群水平的相關因素，探討影響腎移植受者移植前免疫細胞變化的因素。
　　方法:分別收集2012年12月至2013年12月于復旦大學附屬中山醫(yī)院泌尿外科腎移植中心行活體親屬腎移植術之健康供腎者及2012年10月至2013年6月于復旦大學附屬中山醫(yī)院腎臟內(nèi)科住院之尿毒癥患者的相關資料，檢測相關臨床生化指標，同時采用流式細胞術檢測淋巴細胞分

10、型。采用單因素方差分析、獨立樣本t檢驗和Kruskal-Wallis檢驗比較ESRD患者與健康志愿者白細胞分類水平，采用雙變量相關分析淋巴細胞亞群與其他臨床及實驗室指標的相關性，采用多因素線性回歸分析T細胞分型與其他臨床及實驗室指標的相關性。
　　結果:在ESRD組和健康對照組間進行比較發(fā)現(xiàn)ESRD組外周血白細胞總數(shù)顯著高于健康對照組[(6.43±2.19)×109 vs.(5.67±1.39)×109，p=0.025]，中性粒細

11、胞數(shù)顯著高于健康對照組[(4.34±1.99)×109 vs.(3.28±1.26)×109，p=0.012]，淋巴細胞數(shù)顯著低于健康對照組[(1.45±0.55)×109 vs.(1.88±0.42)×109，p=0.007]，中性粒細胞/淋巴細胞比值顯著高于健康對照組(3.60±3.08 vs.1.83±0.85，p=0.007)。
　　在ESRD組與健康對照組中對年齡、性別因素回歸后，白細胞總數(shù)在組間不存在顯著性差異，而中性

12、粒細胞數(shù)(p=0.015)、淋巴細胞數(shù)(p=0.001)、NLR(p＜0.001)在組間仍有顯著性差異。
　　將ESRD組患者根據(jù)不同透析方式分為未透析組、血透組和腹透組，發(fā)現(xiàn)健康對照組外周血淋巴細胞數(shù)分別顯著高于未透析組（1.88±0.42 vs.1.49±0.65，p=0.002）、血透組（1.88±0.42 vs.1.45±0.48，p=0.023）和腹透組（1.88±0.42 vs.1.39±0.48，p=0.001）;而

13、不同透析組之間無顯著性差異。單因素相關性分析顯示ESRD患者外周血中性粒細胞數(shù)與糖尿病、CVD、血磷、NT-proBNP、hsCRP、降鈣素原等呈顯著正相關，與白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、25OH-vitD等呈顯著負相關（p均＜0.05）;淋巴細胞數(shù)與eGFR、血紅蛋白、前白蛋白、膽固醇、甘油三酯、LDL-C、二氧化碳、血鈣、轉(zhuǎn)鐵蛋白等呈顯著正相關，與β2-微球蛋白、尿素、肌酐、NT-proBNP、hsCRP、iPTH、降鈣素原、促紅素等呈顯著負

14、相關（p均＜0.05）;B細胞數(shù)與收縮壓、eGFR、血紅蛋白、白蛋白、前白蛋白、膽固醇、甘油三酯、LDL-C、轉(zhuǎn)鐵蛋白等呈顯著正相關，與年齡、β2-微球蛋白、尿素、肌酐、NT-proBNP、hsCRP、降鈣素原、促紅素等呈顯著負相關（p均＜0.05）。多因素線性回歸分析顯示CD3+T細胞數(shù)與收縮壓、BMI、肌酐、膽固醇、鈣呈獨立正相關，與吸煙史、舒張壓、β2-微球蛋白、白蛋白、尿素呈獨立負相關（p均＜0.05）;CD3+CD4+T細胞數(shù)

15、與收縮壓、LDL-C呈獨立正相關，與高血壓史、舒張壓、β2-微球蛋白、尿素、hsCRP呈獨立負相關(p均＜0.05);CD3+CD8+T細胞數(shù)與肌酐、膽固醇呈獨立正相關，與吸煙史、β2-微球蛋白呈獨立負相關（p均＜0.05）。
　　結論:腎移植受者移植前免疫狀態(tài)和健康對照組不同，這可能與ESRD患者合并脂代謝紊亂、尿毒癥毒素潴留等因素有關。
　　第三部分硫酸吲哚酚和硫酸對甲酚對淋巴細胞增殖影響研究
　　目的:硫酸吲哚酚

16、和硫酸對甲酚是新近發(fā)現(xiàn)的兩種與蛋白質(zhì)結合的尿毒癥毒素，在慢性腎臟病及腎移植受者中，它們與腎功能密切相關。研究表明這兩種毒素可以激活固有免疫細胞，但有關其對適應性免疫細胞影響的研究未見報道。本部分擬探討硫酸吲哚酚和對甲酚對淋巴細胞增殖或凋亡是否存在影響，并初步探討此種影響是否呈時間或濃度依賴性。
　　方法:收集健康志愿者外周血標本，提取外周血單個核細胞后分離并培養(yǎng)淋巴細胞，在5％ CO2、37℃的環(huán)境下用合適的細胞培養(yǎng)液及適宜濃度的

17、PHA培養(yǎng)淋巴細胞，并在培養(yǎng)體系中分別加入不同濃度的硫酸吲哚酚(10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml)或不同濃度的對甲酚(0.10mmol/L、0.25mmol/L、0.50mmol/L)，與淋巴細胞共同孵育，同時設立對照組，共同孵育12h、24h、48h結束后收集各組細胞，進行細胞計數(shù)并用CCK-8 kit檢測各孔淋巴細胞吸光度，評價其增殖或凋亡水平。
　　結果:在PHA刺激下，將IndS與外周血淋巴細胞共培養(yǎng)24h，

18、結果顯示IndS50μg/ml組淋巴細胞增殖度顯著高于空白對照組及IndS10μg/ml組(p均＜0.05); PC與外周血淋巴細胞共培養(yǎng)24h，結果顯示PC0.50mmol/L組淋巴細胞增殖度顯著高于空白對照組及PC0.10mmol/L組（p均＜0.01）。IndS與外周血淋巴細胞共培養(yǎng)12h后，IndS10μg/ml組淋巴細胞增殖度顯著高于空白對照組(p＜0.05)，然而與各個高濃度組無顯著性差異，高濃度IndS組與空白對照組亦無顯

19、著性差異。IndS與外周血淋巴細胞共培養(yǎng)48h后，不同濃度IndS組淋巴細胞增殖度顯著高于空白對照組（p均＜0.01），各組間無顯著性差異。PC與外周血淋巴細胞共培養(yǎng)12h或48h后，不同濃度PC組淋巴細胞增殖度顯著高于空白對照組（p均＜0.01），各組間無顯著性差異。
　　結論:在體外條件，適宜濃度PHA刺激下，硫酸吲哚酚和對甲酚會促進人外周血淋巴細胞的增殖，并且共培養(yǎng)24h時硫酸吲哚酚和對甲酚對淋巴細胞的促增殖作用呈濃度依賴性