當(dāng)歸多糖的制備、結(jié)構(gòu)分析和抗輻射效應(yīng)研究.pdf

1、當(dāng)歸(RadixAngelicasinesis)為傘形科(Umbrelliferae)草本植物，具有多種生理功能，在我國(guó)自古至今一直被廣泛用于多種疾病的治療，素有“十方九歸”之稱。當(dāng)歸多糖是當(dāng)歸的主要生物活性成分。目前國(guó)內(nèi)對(duì)當(dāng)歸多糖的研究主要側(cè)重于調(diào)節(jié)免疫力、抗癌等藥理和功效，對(duì)其結(jié)構(gòu)研究較少，且不夠深入。本論文對(duì)甘肅岷歸多糖的制備、結(jié)構(gòu)特征和抗輻射效應(yīng)進(jìn)行了研究，研究結(jié)果如下： 分析了原料當(dāng)歸的化學(xué)組成：水分11.0％，粗蛋白

2、18.5％，粗脂肪3.8％，灰分8.1％，纖維素9.6％，還原糖37.7％，多糖10.1％。比較了水提粗多糖W-ASP和EDTA/堿提粗多糖E-ASP的得率和提取率：W-ASP得率為10.8％，占總得率(15.2％)的71.1％；E-ASP得率為4.4％，占總得率的28.9％，表明W-ASP是粗多糖的主要組成部分。W-ASP的提取率為5.7％，占當(dāng)歸多糖總含量(10.1％)的56.4％；E-ASP提取率為1.8％，占總量的17.8％。

3、 W-ASP和E-ASP的化學(xué)組成分別為：多糖54.36％/43.82％，糖醛酸24.80％/36.26％，蛋白8.34％/14.40％，灰分21.66％/19.73％。中性糖由Gal、Ara、Gle、Rha和少量Man組成。E-ASP的糖醛酸、蛋白質(zhì)以及Glc含量高于W-ASP。 選用外周血白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量以及體重作為W-ASP和E-ASP的抗輻射活性篩選指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，W-ASP和E-ASP對(duì)經(jīng)3.0Gy60C

4、oγ射線照射小鼠的外周血白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞均有保護(hù)作用，對(duì)體重的回升也有促進(jìn)作用，但E-ASP的效果不如W-ASP。運(yùn)用響應(yīng)面分析方法，確定了當(dāng)歸水提粗多糖的最佳工藝參數(shù)：浸提溫度85℃，浸提時(shí)間2h，浸提2次，料水比1∶10。 對(duì)水提當(dāng)歸粗多糖的分級(jí)純化和化學(xué)組成進(jìn)行了研究。W-ASP經(jīng)DEAE-SepharoseCL-6B柱層析分級(jí)后得到3個(gè)多糖組分：W-ASP1為中性多糖，W-ASP2為弱酸性多糖(糖醛酸含量35.38％)，

5、W-ASP3為酸性多糖(糖醛酸含量58.27％)。W-ASP3是當(dāng)歸多糖的主要組分，蛋白含量為2.53％，主要由Gal、Ara和Rha組成，以及極少量的Glc和Man；HPLC凝膠過(guò)濾色譜分析表明W-ASP3為均一組分，平均分子質(zhì)量約為95KDa；HPAEC-PAD色譜分析結(jié)合單糖組成和IR圖譜確定是一種果膠多糖。 分別采用比色法、GC-MS和HPAEC-PAD色譜技術(shù)測(cè)定了當(dāng)歸果膠多糖W-ASP3的糖醛酸含量，并對(duì)三種檢測(cè)方法

6、進(jìn)行比較。HPAEC-PAD法(53.62％)和GC-MS法(56.06％)測(cè)定的GalA含量均略低于比色法(58.27％)。 采用傅里葉變換紅外光譜法(FT-IR)測(cè)定了當(dāng)歸多糖樣品的酯化度(DE)。通過(guò)建立DE與A1730/(A1730+A1630)之間的線性回歸方程(R2=0.822)，測(cè)得當(dāng)歸粗多糖及其分級(jí)組分的酯化度介于42.36％～54.06％之間。將FT-IR法與化學(xué)滴定法進(jìn)行了比較，兩種方法測(cè)得的DE值之間的相對(duì)

7、誤差在8％左右。 對(duì)W-ASP1和W-ASP3的抗輻射活性進(jìn)行篩選。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，W-ASP1和W-ASP3對(duì)經(jīng)3.0Gy60Coγ射線照射小鼠的外周血白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞均有保護(hù)作用，對(duì)體重的回升也有促進(jìn)作用，但W-ASP3的效果好于W-ASP1。 體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)考察了W-ASP3對(duì)亞急性輻射損傷的防護(hù)作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，W-ASP3對(duì)經(jīng)輻射損傷后，由于Bcl-2與Bax異常表達(dá)而產(chǎn)生的肝細(xì)胞凋亡有抑制作用，并通過(guò)提高Bc

8、l-2/Bax比值減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生，促進(jìn)肝細(xì)胞的修復(fù)和增殖。體外實(shí)驗(yàn)顯示W(wǎng)-ASP3能有效地抑制骨髓PCE微核的形成，加速造血機(jī)能的恢復(fù)，降低外周血淋巴細(xì)胞的凋亡水平，使外周血白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量回升；同時(shí)通過(guò)促進(jìn)外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化、降低肝細(xì)胞的膜脂質(zhì)過(guò)氧化水平增強(qiáng)機(jī)體的輻射耐受性，提示當(dāng)歸多糖具有一定的抗輻射功能，對(duì)亞急性輻射損傷小鼠有良好的防護(hù)作用。 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)考察了W-ASP3對(duì)亞慢性輻射損傷小鼠的防護(hù)作用。結(jié)果表明，W-

9、ASP3能有效抑制骨髓細(xì)胞凋亡的發(fā)生和骨髓PCE微核的形成，加速造血機(jī)能的恢復(fù)，使外周血白細(xì)胞數(shù)量回升；同時(shí)通過(guò)促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化和肝細(xì)胞增殖活性、抑制肝細(xì)胞凋亡、降低睪丸細(xì)胞的膜脂質(zhì)過(guò)氧化水平，保護(hù)生殖系統(tǒng)功能來(lái)增強(qiáng)機(jī)體的輻射耐受性，提示當(dāng)歸多糖具有一定的抗輻射功能，對(duì)亞慢性輻射損傷小鼠有良好的防護(hù)作用。 探討了當(dāng)歸多糖的抗輻射機(jī)制，主要表現(xiàn)為：1)增強(qiáng)細(xì)胞DNA損傷修復(fù)能力，提高輻射耐受性；2)清除自由基、保護(hù)細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)；

10、3)增強(qiáng)機(jī)體免疫能力，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用等三個(gè)方面。 采用部分酸水解、酶解、羧基還原和甲基化分析等方法，結(jié)合GC-MS、NMR和FT-IR等測(cè)試手段對(duì)當(dāng)歸多糖W-ASP3的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示：W-ASP3的糖殘基構(gòu)型主要為α-D-GalpA、β-D-Galp、α-L-Araf和α-L-Rhap，主鏈由1,4-D-GalpA連接形成“光滑區(qū)”半乳糖醛酸聚糖、由1,4-D-GalpA通過(guò)O-4位與1，2-、1,2,4-L-Rhap

11、的O-2位交替連接形成含有較多分支的“毛發(fā)區(qū)”鼠李半乳糖醛酸聚糖；半乳糖醛酸聚糖是多糖鏈的主要組成部分，其中有部分羧基被甲酯化，部分O-2或O-3位被乙酰基取代。T-，1,5-，1,3,5-Araf和T-，1，3-，1，3，6-，1，4-，1,4,6-D-Galp聚合形成的阿拉伯半乳聚糖、半乳聚糖以及阿拉伯聚糖是W-ASP3側(cè)鏈的主要組成，通過(guò)Rhap殘基的O-4位與主鏈相連。62.4％的Ara位于非還原性末端，T-Araf除了與主鏈R

12、hap殘基的O-4位相連外，還連接于1,5-Araf的O-3位或O-5位以及1,6-Galp的O-3位；37.6％的Araf殘基以1→5連接方式成為阿拉伯聚糖的主鏈，其中近一半的Araf殘基(48.7％)在O-3位有分支；72.8％的Galp殘基為1→6連接，其中近一半的Galp殘基(47.9％)在O-3位有分支，部分T-D-Galp的O-2位被甲基取代為2-O-Mee-β-D-Galp。 對(duì)當(dāng)歸多糖的抗輻射功能的構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行了