當(dāng)歸多糖核標(biāo)記及其肝靶向作用的研究.pdf

1、藥材當(dāng)歸[Angelica sinensis]為傘形科植物(Umbeliferae)當(dāng)歸的干燥根莖,是我國著名中藥，素有“十方九歸”之稱。當(dāng)歸多糖是其主要活性成分，具有保肝護(hù)脾，補(bǔ)血活血的藥理作用?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明當(dāng)歸多糖對多種疾病特別是調(diào)節(jié)糖脂代謝，抗炎，提高免疫力有很好的療效。近年來，本課題組深入研究當(dāng)歸多糖對急性、慢性肝損傷的保護(hù)作用分子機(jī)制，通過當(dāng)歸多糖在動(dòng)物體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)、組織分布及大鼠原代肝細(xì)胞體外對當(dāng)歸多糖的攝取，發(fā)現(xiàn)

2、當(dāng)歸多糖的肝靶向性，并利用異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記當(dāng)歸多糖，但無法得到直觀描述肝靶向的活體成像圖。
　　為了得到當(dāng)歸多糖在動(dòng)物活體內(nèi)的高清成像圖，直觀證明其肝靶向性及體內(nèi)分布，本論文擬設(shè)計(jì)對當(dāng)歸多糖進(jìn)行核素標(biāo)記，借助單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層成像術(shù)/電子計(jì)算機(jī)斷層掃描(SPECT/CT)采集顯像，并通過高分辨率活體成像圖研究當(dāng)歸多糖的肝靶向性。在此基礎(chǔ)上，通過研究當(dāng)歸多糖顯像劑在移植瘤裸鼠體內(nèi)的SPECT分布圖，進(jìn)一步探討了當(dāng)歸多

3、糖顯像劑對動(dòng)物體內(nèi)腫瘤的探測能力。因此，本研究主要意義在于構(gòu)建99mTc標(biāo)記當(dāng)歸多糖探針，實(shí)現(xiàn)了當(dāng)歸多糖在體內(nèi)的活體成像。
　　第一部分：當(dāng)歸多糖核標(biāo)記物的制備、純化、鑒定及穩(wěn)定性研究。
　　以地道岷縣當(dāng)歸根片為原料，采用水提、酸堿除蛋白和醇沉法得到當(dāng)歸飲片中的當(dāng)歸粗多糖，再經(jīng)透析和G50葡聚糖凝膠柱分離純化得到糖含量約為91％、分子量約為1.159×105Da的精制當(dāng)歸多糖（ASP）。二乙三胺五乙酸（DTPA）是一種重要的

4、多齒配體，分子結(jié)構(gòu)中含有3個(gè)N原子和5個(gè)-COOH結(jié)構(gòu)，是核醫(yī)學(xué)常用雙功能高效螯合劑，而DTPA的酸酐形式二乙三胺五乙酸雙酸酐（DTPAA），含有易與多糖羥基反應(yīng)的基團(tuán)。以ASP為原材料，與DTPAA反應(yīng)后，經(jīng)透析純化，得到DTPA-ASP標(biāo)記中間體。取新鮮99mTc淋洗液加入微量SnCl2還原，標(biāo)記DTPA-ASP，得到99mTc-DTPA-ASP。以生理鹽水為層析液，采用薄層色譜層析技術(shù)檢測99mTc-DTPA-ASP標(biāo)記率約為72

5、%（n=5）。使用PD-10脫鹽柱對標(biāo)記物進(jìn)行純化，繪制流出曲線及檢測糖含量，得到柱后放化純＞96%（n=5）的當(dāng)歸多糖锝標(biāo)記物。锝標(biāo)記產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果均符合所得產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)特征，其中，DTPA-ASP傅里葉紅外光譜分析結(jié)果顯示在1725cm-1處有明顯羰基（-COOR）特征吸收峰；DTPA-ASP核磁共振氫譜分析顯示特征化學(xué)位移(δ2.554H,2.604H,3.102H,3.188Hppm,DTPA)；99mTc-DTPA-ASP

6、核素化合物在瞬時(shí)硅膠薄層紙（ITLC-SG）上的Rf為0.1，而新鮮99mTc淋洗液（Na99mTcO4）的Rf為0.9。99mTc-DTPA-ASP在PBS和胎牛血清中1、2、4、8及24h后的穩(wěn)定性結(jié)果顯示，兩種環(huán)境下4h放化純＞90%，24h后放化純?nèi)裕?3%，表明99mTc-DTPA-ASP標(biāo)記物核素特征明顯，標(biāo)記物穩(wěn)定且滿足體內(nèi)顯像研究條件。
　　第二部分：當(dāng)歸多糖核標(biāo)記物在正常動(dòng)物體內(nèi)顯像及肝靶向作用研究。
　　

7、經(jīng)靜脈注射99mTc-DTPA-ASP，利用99mTc-DTPA-ASP可發(fā)射γ射線的性質(zhì)，使用體內(nèi)單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層成像術(shù)（SPECT）采集顯像，于0.25、0.5、1和2h時(shí)間點(diǎn)，得到當(dāng)歸多糖在Balb/c小鼠、SD大鼠及大白兔體內(nèi)高清成像圖。Balb/c小鼠靜脈注射標(biāo)記藥物后不同時(shí)間點(diǎn)測各組織，包括血、腦、心、肺、肝、脾、胃、小腸、大腸、腎、肌肉及骨中克組織百分注射劑量率（%ID/g），于0.25、0.5、1和2h時(shí)間點(diǎn)，得到當(dāng)

8、歸多糖在動(dòng)物各組織的分布數(shù)據(jù)。體內(nèi)SPECT顯像顯示肝臟的核素亮斑明顯高出其它組織，組織分布實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明1h后99mTc-DTPA-ASP在肝臟組織分布的濃聚高達(dá)98.23%ID/g，直觀圖像和定量數(shù)據(jù)均證實(shí)當(dāng)歸多糖具有肝靶向濃聚特性。半乳糖人血清白蛋白（NGA）是一種能特異性結(jié)合唾液酸糖蛋白受體（ASGPR）的受體拮抗劑，在研究當(dāng)歸多糖可能經(jīng)ASGPR途徑進(jìn)入肝細(xì)胞的機(jī)制實(shí)驗(yàn)中，提前5min靜脈注射NGA，觀察99mTc-DTPA-A

9、SP在體內(nèi)的SPECT圖及組織分布變化。結(jié)果表明，NGA拮抗后，動(dòng)物肝臟對99mTc-DTPA-ASP的攝取率降低、亮斑減弱，證實(shí)當(dāng)歸多糖具有主動(dòng)肝靶向性且經(jīng)ASGPR途徑進(jìn)入肝細(xì)胞。本研究中對當(dāng)歸多糖在動(dòng)物體內(nèi)活體成像和組織分布方法的建立，為其它植物大分子多糖的核標(biāo)記、活體成像提供了一種可行方法。
　　第三部分：當(dāng)歸多糖核標(biāo)記物在癌細(xì)胞中攝取及荷瘤鼠體內(nèi)顯像研究。
　　本論文研究了體外不同時(shí)間點(diǎn)HepG2和PC3癌細(xì)胞對9

10、9mTc-DTPA-ASP的攝取率，細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著孵育時(shí)間的延長，肝癌細(xì)胞HepG2和非肝癌細(xì)胞PC3對當(dāng)歸多糖的攝取率逐漸增加，并在4h后達(dá)到穩(wěn)定，約為4.3%，說明兩種癌細(xì)胞對當(dāng)歸多糖無明顯特異性吸收。同時(shí)構(gòu)建了HepG2和PC3癌細(xì)胞兩種裸鼠腋下移植瘤模型,通過SPECT顯像來研究荷瘤鼠模型對當(dāng)歸多糖體內(nèi)分布的影響，顯像結(jié)果顯示，荷瘤鼠注射99mTc-DTPA-ASP后，兩種模型腫瘤組織部分在SPECT圖中出現(xiàn)顯影，但