mTOR-MAPK信號轉導途徑對細胞倍體化的作用及修飾機制.pdf

1、本文分別使用nocodazole(NOCO)和佛波酯(PMA)誘導Dami細胞(一個巨核細胞白血病細胞系)，分別建立相對同步化的多倍體化和成熟分化占優(yōu)勢的兩種細胞模型，比較可能參與細胞多倍體化細胞周期調控分子和信號轉導分子表達、磷酸化狀態(tài)在這兩種細胞模型上的差別，研究雷帕霉素靶蛋白（mTOR）和MAPK信號轉導途徑對其調控的機制，為揭示細胞多倍性的分子機制提供理論依據。 方法：在本項研究中，我們分別使用nocodazole(NO

2、CO)和佛波酯(PMA)誘導Dami細胞，臺盼蘭拒染法計數細胞數量及觀察細胞活力；流式細胞儀分析細胞周期、DNA倍性和表型變化；姬姆薩染色觀察細胞形態(tài)學特征；免疫印跡分析細胞周期蛋白表達；確定建立了相對同步化的多倍體化和分化分別占優(yōu)勢的兩種細胞模型。熒光染色結合顯微鏡及激光掃描共聚焦顯微鏡觀察P-P70S6K1(Thr421/Ser424)的細胞定位；采用流式細胞儀和免疫印跡分析cyclins、CDKs、CKIs及mTOR、MAPK下游

3、相關蛋白表達及磷酸化修飾的變化；特異性的阻斷MAPK通路檢測mTOR、MAPK下游相關蛋白表達及磷酸化修飾的變化；以揭示細胞周期調控分子及信號轉導分子在巨核細胞多倍體化和分化過程中所起的作用。 結果：1.NOCO抑制細胞生長的濃度為50ng/ml；通過3天誘導后87﹪的Dami細胞臺盼藍拒染；多倍性細胞(≥8N)的百分比從第0天的5.3﹪±1.2﹪升至第3天的69.7﹪±10.2﹪；形態(tài)學上，第1天就觀察到Dami細胞的M期阻滯

4、，2天后觀察到少細胞質的巨核細胞樣多倍性細胞。PMA輕微地改變了多倍性細胞的比例，從第0天的5.3﹪±1.2﹪到第3天的10.7﹪±1.4﹪；形態(tài)學顯示PMA誘導的多倍性細胞有更多的細胞質。PMA上調巨核細胞標記CD61的表達而且顯著地升高了cyclinD1的表達。2.NOCO和PMA均能誘導Dami細胞中cyclinB1表達，呈與二倍體相同的細胞周期分布。3.NOCO顯著地促進4EBP1的Thr37/Thr46/Ser65位點、P70

5、S6K1的Thr421/Ser424位點的磷酸化，而PMA無此種作用。4.NOCO上調P27而PMA上調P21和cyclinD1的表達。5.P70S6K1在成熟的巨核細胞樣多倍性細胞中被磷酸化并定位于細胞質中。6.PD98095通過對P-P70S6K1(Thr421/Ser424)和P-4EBP1(Ser65)的磷酸化顯著地升高Dami細胞的倍性；U0126減低了P-P70S6K1(Thr421/Ser424)、S6和4EBP1的磷酸化

6、，并且減低Dami細胞的倍性。 結論：1.NOCO與PMA分別誘導Dami細胞，成功建立了相對同步化多倍性細胞周期和成熟分化分別占優(yōu)勢的兩種細胞模型。2.P27可能與NOCO誘導的Dami細胞巨核細胞樣多倍體化有關；而cyclinD1和P21可能與PMA誘導的Dami細胞成熟分化有關。3.NOCO和PMA均能誘導Dami細胞中cyclinB1表達，呈與二倍體相同的細胞周期分布。cdc2的活性在NOCO誘導Dami細胞多倍體化的過

7、程中可能被抑制。4.在Dami細胞中，NOCO和PMA以不同的方式調節(jié)翻譯，參與細胞多倍體化和分化的調控因子及信號轉導通路是不同的。5.mTOR下游蛋白P70S6K1的Thr421/Ser424位點的磷酸化對巨核細胞的多倍體化是必不可少的，4EBP1的磷酸化可能與P70S6K1協(xié)同作用共同參與巨核細胞的多倍體化。6.在NOCO誘導的Dami細胞中，PD98095使mTOR下游蛋白P-P70S6K1(Thr421/Ser424)和P-4E