DAA-Ⅰ對心肌微血管內(nèi)皮細胞缺血-再灌注損傷的作用及機制研究.pdf

1、實驗背景及目的:
　　心肌缺血/再灌注損傷(myocardium ischemia/reperfusion injury,MIRI)是急性心肌梗死患者再灌注治療時經(jīng)常伴隨的重要病理生理反應(yīng),已成為阻礙心肌從再灌注治療中獲得最佳療效的主要難題。MIRI機制復(fù)雜,目前尚缺乏有效的臨床防治手段。近期研究發(fā)現(xiàn),微循環(huán)障礙及血管內(nèi)皮功能障礙是其重要的病理生理機制之一。Scarabelli等的報道也證實,心肌微血管內(nèi)皮細胞(cardiac m

2、icrovascular endothelial cell,CMECs)在MIRI中具有關(guān)鍵作用。去天門冬氨酸血管緊張素Ⅰ(des-aspartate-angiotensinⅠ,DAA-Ⅰ)是一種內(nèi)源性的血管緊張素Ⅱ拮抗劑,以往研究表明DAA-Ⅰ可通過抑制炎癥反應(yīng)從而減輕MIRI,保護心臟。然而,DAA-Ⅰ對缺血/再灌注損傷(ischemia/reperfusion injury,I/RI)時心肌微血管內(nèi)皮細胞是否有保護作用及其機制仍不

3、明確。
　　缺氧、鈣離子平衡失調(diào)、自由基等均可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙,觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS),是缺血性心臟病的重要發(fā)病機制之一,有研究證實ERS參與了心肌I/RI時心肌細胞的凋亡。然而,ERS是否參與了I/RI誘導(dǎo)心肌微血管內(nèi)皮細胞的損傷及凋亡,且其在DAA-Ⅰ抑制I/R誘導(dǎo)的CMECs損傷中發(fā)揮的作用及機制尚不明確。因此,本實驗將在細胞水平建立SI/R模型,研究DAA-Ⅰ是

4、否能夠抑制I/R過程中CMECs損傷,以及ERS是否參與此過程,并進一步探討ERS在此過程中發(fā)揮的作用及機制。
　　實驗方法:
　　1、分離培養(yǎng)大鼠CMECs,建立模擬缺血/再灌注(simulated ischemia reperfusion,SI/R)模型,完全隨機分組,分為對照組、模擬缺血/再灌注組(SI/R組)、模擬缺血/再灌注+DAA-Ⅰ(2.5、3.75、5.0μmol/L)組。
　　2、MTT檢測細胞增殖能

5、力,細胞劃痕實驗及Transwell小室檢測細胞遷移能力,caspase3酶活性檢測及TUNEL法檢測細胞凋亡。
　　3、采用Western blot檢測GRP78/Bip、CHOP/GADD153、cleavedcaspase-12蛋白的表達;采用Real-timeqPCR法檢測GRP78、CHOP/GADD153在mRNA水平的表達。
　　結(jié)果:
　　1、分離和培養(yǎng)心肌微血管內(nèi)皮細胞并成功建立SI/R模型。

6、　　2、與對照組相比較,SI/R組CMECs增殖能力明顯降低(P<0.01),凋亡率顯著上升[(24.85±0.67)％比(3.55±0.11)%,P<0.01]。與SI/R組相比,SI/R+DAA-I組細胞增殖能力明顯升高(P<0.01)并呈劑量依賴性,細胞遷移率上升(P<0.01),caspase3酶活性明顯降低(P<0.01),凋亡指數(shù)明顯下降[(15.18±0.40)%比(24.85±0.67)%,P<0.01]。
　　3

7、、WB結(jié)果顯示:與對照組相比較,SI/R組和SI/R+DAA-I組的GRP78、CHOP/GADD153、cleavedcaspase-12表達明顯上升(均為P<0.01);與SI/R組相比,SI/R+DAA-I組的GRP78、CHOP/GADD153、cleavedcaspase-12表達明顯降低(均為P<0.01)。Real-timeqPCR結(jié)果顯示:對照組與SI/R組相比較,SI/R組的GRP78mRNA、CHOP/GADD153