構(gòu)建永生化的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞.pdf

1、目的：構(gòu)建永生化的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。 方法：采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)法將病毒質(zhì)粒pBabepuro-hTERT導(dǎo)入包裝細(xì)胞內(nèi)，嘌呤霉素(Puro)篩選出病毒表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞克隆，測(cè)定病毒滴度。取培養(yǎng)病毒的上清液感hBMSCs細(xì)胞、篩選出轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，我們將其命名為hTERT-hBMSCs細(xì)胞。采用端粒酶重復(fù)序列擴(kuò)增(telomere repe at amplification protocol assay，TRAP)酶鏈免疫吸附試驗(yàn)(

2、ELISA)法檢測(cè)hBMSCs細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后端粒酶活性的變化；采用MTT法(四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法)測(cè)繪轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，觀察hTERT轉(zhuǎn)入后對(duì)細(xì)胞增殖的影響：克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)hTERT-hBMSCs細(xì)胞的增殖能力；染色體核型分析觀察hTERT-hBMSCs細(xì)胞染色體是否正常；成骨試劑盒檢測(cè)hTERT-hBMSCs細(xì)胞向成骨分化的能力。 結(jié)果：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為貼壁生長(zhǎng)的梭形細(xì)胞，表面抗原CD44表達(dá)陽(yáng)性，CD34陰性

3、。TRAP-ELISA法檢測(cè)轉(zhuǎn)染hTERT的hBMSCs細(xì)胞的端粒酶為陽(yáng)性，而未轉(zhuǎn)錄的正常人的hBMSCs細(xì)胞則為陰性，說(shuō)明轉(zhuǎn)入hTERT基因后細(xì)胞端粒酶激活。hTERT-hBMSCs細(xì)胞比hBMSCs細(xì)胞增殖活躍，兩組相比有顯著的差異性，目前已傳了11代，尚未見衰老跡象。染色體核型分析所示：hTERT-hBMSCs細(xì)胞染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)正常，未見缺失、斷裂、異位等畸變。成骨誘導(dǎo)結(jié)果表明hTERT-hBMSCs細(xì)胞仍具有向成骨分化的能力。