致鵝卵黃性腹膜炎性大腸桿菌的部分生物學特性研究.pdf

1、本文進行了如下研究： 1、致鵝卵黃性腹膜炎性大腸桿菌的分離鑒定 對臨床鵝卵黃性腹膜炎病例進行了細菌分離，染色鏡檢、形態(tài)觀察、糖發(fā)酵試驗、IMViC試驗、TSI斜面接種試驗和O抗原血清凝集試驗等傳統(tǒng)細菌分類鑒定，在此基礎上擴增了E0238、E0239、E0240三個菌株的16S rDNA，通過測序和序列分析，證明獲得的7株細菌為大腸桿菌，編號為E0238、E0239、E0240、E0453、E0454、E0241、E024

2、5,其血清型分別為O2、O21、O37、O1、O24、O24、O148。 2、致鵝卵黃性腹膜炎性大腸桿菌毒力相關基因檢測 根據(jù)網(wǎng)上已經(jīng)公布的大腸桿菌毒力相關基因的序列，設計引物，以致鵝卵黃性腹膜炎性大腸桿菌E0238、E0239、E0240為試驗對象，用PCR方法檢測其毒力相關基因。試驗結果顯示，所檢測的11個毒力相關基因中，三株致鵝卵黃性腹膜炎性大腸桿菌的fimC基因均為陽性，且均未檢測到hlyE和tsh基因，其中E0

3、239(血清型O21)具有九種毒力基因(fimC-papC-fyuA-irp2-aer-iss-colV-vat-stx2f)，而E0238(血清型O2)、E0240(血清型O37)兩株細菌只檢測到了fimC基因的存在。提示Ⅰ型菌毛等基因可能與致鵝卵黃性腹膜炎有一定關系。 3、致鵝卵黃性腹膜炎性大腸桿菌Ⅰ型菌毛fimFGH基因的序列分析 根據(jù)Genbank公布的fimFGH序列設計引物，對3株致鵝卵黃性腹膜炎性大腸桿菌E

4、0238、E0239、E0240的Ⅰ型菌毛fimFGH基因進行了PCR擴增、克隆和測序。序列分析結果表明，fimF、fimG、fimH基因及其所編碼蛋白與Genbank中相關序列的同源性很高(同源性>96％)，其中以基因fimH及其編碼蛋白的保守性最高(同源性>98％)，部分達到100％。研究發(fā)現(xiàn)FimH蛋白的主要變異集中分布在FimH粘附素N末端的4個氨基酸位點(N91S99→S91N99或N91N99；A48→V48；N156→K1

5、56即成熟FimH蛋白的N70S78→S70N78或S70N78；A27→V27；N135→K135)，本研究中在這4個氨基酸位點中僅有E0239菌株發(fā)生了變異(A48→V48即成熟蛋白A27→V27)；FimF、FimG蛋白各有一個多變區(qū)域，分別位于111～124位氨基酸位點之間和4～16位氨基酸位點之間，其中E0238、E0239菌株FimF蛋白發(fā)生了A111→S111的變異，E0238、E0240菌株FimG蛋發(fā)生了C4V9→R4

6、L9的變異，但其變異的具體意義需更進一步研究證實。 4、致鵝卵黃性腹膜炎性大腸桿菌菌體特異性蛋白的初步鑒定 分別對致鵝卵黃性腹膜炎性大腸桿菌E0238、E0239、E0240進行細菌培養(yǎng)，將其懸浮于滅菌生理鹽水制成細菌懸液(108個細菌/ml)，1.5‰甲醛滅活后離心后將菌體重懸于滅菌生理鹽水并分別取0.1ml并與等體積佐劑充分混合后，分別腹腔接種免疫不同的ICR小鼠，加強免疫3次，最后一次免疫不加佐劑，免疫間隔時間為1

7、2-14天，最后一次免疫后12天分離抗血清。然后與同血清型的雞源大腸桿菌菌體裂解物共溫育，去除交叉反應性抗體，通過SDS-PAGE和Western blotting分析和鑒定致鵝卵黃性腹膜炎性大腸桿菌菌體特異性抗原。研究結果顯示，致鵝卵黃性腹膜炎性大腸桿菌E0238(血清型為02)、E0239(血清型為021)存在一個差異性表達的蛋白，大小大約為68kDa。 5、致鵝卵黃性腹膜炎性大腸桿菌外膜蛋白的鑒定 為了研究致鵝卵黃

8、性腹膜炎性大腸桿菌與其它大腸桿菌在外膜蛋白表達上的異同，分別提取了5株致鵝卵黃性腹膜炎性大腸桿菌和2株從雞分離的大腸桿菌的外膜蛋白，通過SDS-PAGE和Western-blotting試驗(抗鵝卵黃性腹膜炎性大腸桿菌的血清)研究發(fā)現(xiàn)致鵝卵黃性腹膜炎性大腸桿菌E0238、E0239均有一條約68kDa的蛋白條帶。將這一特異蛋白條帶從SDS-PAGE凝膠中切取后，進行MALDI-TOF質譜分析，獲得的肽質量指紋譜(PMF)數(shù)據(jù)經(jīng)MASCO