新型低溫堿性蛋白酶的純化和性質(zhì)研究.pdf

1、蛋白酶是三大工業(yè)用酶之一，產(chǎn)值約占國(guó)際酶市場(chǎng)的60％。由于其在洗滌，皮革，絲綢，醫(yī)藥、食品、廢物處理、小肽合成等各個(gè)行業(yè)表現(xiàn)出的廣闊應(yīng)用前景及巨大商業(yè)價(jià)值，蛋白酶一直是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。
　　 本研究從土壤中篩選到一株低溫堿性蛋白酶生產(chǎn)菌，其生理生化性質(zhì)與Pseudomonas mosselii相近，經(jīng)16s rDNA鑒定與Pseudomonas mosselii相似性高達(dá)99％，將其命名為Pseudomonas mosseli

2、i XG1。
　　 研究發(fā)現(xiàn)P.mosselii XG1蛋白酶在低溫下穩(wěn)定性良好，并在常溫或低溫下能有效降解發(fā)酵液中的雜蛋白。利用此性質(zhì)將Pseudomonas mosselii XG1發(fā)酵液在4℃下放置72h后經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀一步純化得到電泳純的蛋白酶，其亞基分子量為45KDa。比活力為2499.5U/mg，純化倍數(shù)為3.56，純化回收率達(dá)到50.7％。
　　 P.mosselii XG1蛋白酶最適pH為9.0，在很寬

3、的pH范圍(pH5.0-12.0)內(nèi)保持高活力；44℃時(shí)活性最高，熱穩(wěn)定性較差，Ca2+能顯著改善酶的熱穩(wěn)定性。Mn2+對(duì)酶活有顯著促進(jìn)作用，F(xiàn)e2+則有微弱抑制作用。金屬蛋白酶抑制劑1，10-菲咯啉對(duì)酶活有抑制，表明活性中心附近可能有Zn2+離子。絲氨酸蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(PMSF)對(duì)酶活力沒(méi)有影響，表明該酶可能不屬于絲氨酸蛋白酶家族。5mmol/L的二硫蘇糖醇抑制了50％的酶活，說(shuō)明二硫鍵可能是穩(wěn)定該蛋白酶三級(jí)結(jié)構(gòu)所必需。以酪

4、蛋白酸水解物為底物測(cè)得P.mosselii XG1蛋白酶的米氏常數(shù)Km為0.607mg/ml，最大反應(yīng)速率υmax為763.359U/ml。
　　 XG1蛋白酶的底物選擇性研究表明該蛋白酶不易水解各種氨基酸對(duì)硝基苯胺的衍生物(常用人工底物)，較易剪切長(zhǎng)鏈的肽鏈。以氧化型牛胰島素B鏈為底物檢測(cè)P.mosselii XG1蛋白酶的切割特異性，反應(yīng)3min時(shí)，蛋白酶的優(yōu)先切割位點(diǎn)為Ala14-Leu15，Leu15-Tyr16，Tyr

5、16-Leu17；反應(yīng)60min后，蛋白酶的酶切位點(diǎn)為Asn3-Gln4，Gln4-His5，Cys7-Gly8，Glu13-Ala14，Ala14-Leu15，Leu15-Tyr16，Tyr16-Leu17，Tyr26-Thr27。
　　 P.mosselii XG1蛋白酶對(duì)鰲合劑EDTA、氧化劑暨漂白劑H2O2和表面活性劑SDS耐受性良好。與各種商業(yè)洗滌劑放置30min后測(cè)定酶活，奧妙()洗衣粉對(duì)酶活力影響最大，處理后殘余酶