HCV core蛋白誘發(fā)肝脂肪變機(jī)制的初步研究.pdf

1、丙型肝炎病毒（hepatitisCvirus，HCV）感染嚴(yán)重影響著全球公共健康，全世界大約有17億HCV感染者。HCV感染者中，約有80％發(fā)展為慢性丙型肝炎，至少有30％的HCV攜帶者發(fā)展成為更嚴(yán)重的肝病，如脂肪肝、肝硬化和肝癌。
　　HCV屬于黃病毒家族中的肝病毒類，其病毒顆粒由一個9.6kb的正性的單鏈RNA片段包裝折疊而成。其基因編碼區(qū)的閱讀框在翻譯后可形成一個由3000個氨基酸組成的蛋白單體。此蛋白單體在翻譯后可黏附于內(nèi)

2、質(zhì)網(wǎng)膜上，并在宿主和病毒的蛋白酶的作用下轉(zhuǎn)化為3個結(jié)構(gòu)蛋白（core蛋白、E1、E2）和7個非結(jié)構(gòu)蛋白（p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)。HCV可以分為7個主基因型和多個亞型。蛋白單體還可與細(xì)胞表面的特異性蛋白綁定，通過網(wǎng)格蛋白的內(nèi)吞作用內(nèi)化，從而啟動生命周期。
　　HCVcore蛋白是22kDa的非糖基化蛋白，由靠近5`端的開放讀碼框編碼。作為典型的黃病毒core蛋白，它富含賴氨酸和精氨酸（N端更明

3、顯））。它與RNA基因組結(jié)合而形成HCV病毒核衣殼。HCVcore蛋白的亞細(xì)胞定位在細(xì)胞質(zhì)。但當(dāng)其C端缺失時，可向核內(nèi)遷移。這表明HCVcore蛋白可能在HCV致病過程中其到直接而關(guān)鍵的作用。
　　長期慢性的HCV感染者體內(nèi)的HCV能夠影響肝細(xì)胞內(nèi)脂類代謝，從而導(dǎo)致脂滴在肝臟中的積聚。同時，肝細(xì)胞內(nèi)的脂滴在HCV生命循環(huán)中也發(fā)揮著非常重要的作用。
　　HCV誘發(fā)脂肪肝、肝硬化最終形成肝癌的機(jī)理尚未闡明。普遍認(rèn)為，HCV通過影

4、響宿主肝細(xì)胞的脂代謝，誘發(fā)脂肪肝，并逐漸發(fā)展為肝硬化、肝癌。HCV誘發(fā)脂肪肝很可能與HCV蛋白和細(xì)胞脂代謝相關(guān)蛋白之間的相互作用有關(guān)。其中HCV的core蛋白是重要的致病因素，它涉及到脂滴累積，脂肪基因表達(dá)的改變和脂肪相關(guān)蛋白的活性。宿主基因表達(dá)對病毒生命周期有協(xié)助作用。長期肝脂肪變的存在可加速肝硬化和肝癌的進(jìn)程。
　　異常的脂代謝能夠加速肝病發(fā)展，而脂滴分子在HCV復(fù)制的過程中又發(fā)揮著關(guān)鍵作用。研究HCVcore蛋白誘發(fā)脂肪肝的

5、分子機(jī)制就顯得尤為重要。通過闡明HCVcore蛋白誘發(fā)脂肪肝的致病機(jī)理，控制感染，抑制脂肪肝的形成，并預(yù)防疾病進(jìn)一步惡化，是目前世界上研究的熱點(diǎn)問題。
　　值得注意的是，HCVcore蛋白3a亞型與其他亞型相比，能夠更加強(qiáng)烈地誘導(dǎo)肝臟脂肪變的形成，但其基因序列與其他亞型相比，只在數(shù)量極少的若干個堿基上有差異。可推測這些差異堿基中具有與肝脂肪變相關(guān)的重要序列，但其通過何種機(jī)制發(fā)揮作用尚不明了。
　　本研究著眼于HCVcore蛋

6、白3a亞型（HCVcore3a）誘發(fā)肝臟脂肪變的分子機(jī)制。我們構(gòu)建了攜帶HA-HCVcore3a基因的重組腺病毒，以攜帶HA-HCVcore1b基因的重組腺病毒作對照，感染原位灌注分離的小鼠原代肝細(xì)胞。在感染24h，48h，72h時間點(diǎn)，分別觀察感染HCVcore3a與HCVcore1b和正常肝細(xì)胞中脂滴的形成大小，數(shù)量等形態(tài)學(xué)特點(diǎn)。
　　PPAR-α是細(xì)胞核激素受體超家族的一員，是正常脂肪細(xì)胞分化過程中所必需的。核轉(zhuǎn)錄因子PPA

7、R-α的主要功能是控制脂肪酸氧化和活化作用。PPAR-α缺乏會導(dǎo)致肝臟中脂肪酸氧化缺陷。因此，我們通過反轉(zhuǎn)錄和實時定量PCR技術(shù)，檢測與脂代謝相關(guān)的宿主細(xì)胞受體PPAR-α和宿主基因ACC1和FAS的mRNA的表達(dá)量的變化，從而進(jìn)一步探究HCVcore蛋白誘導(dǎo)肝臟脂肪變的分子機(jī)制。
　　【目的】
　　1.研究HCVcore3a蛋白在小鼠原代肝細(xì)胞中表達(dá)時誘導(dǎo)脂滴形成的大小，數(shù)量等形態(tài)指標(biāo)；
　　2.通過實時定量PCR技

8、術(shù)檢測宿主細(xì)胞受體PPAR-α，宿主基因ACC1和FAS的mRNA的表達(dá)量，研究HCVcore蛋白與宿主細(xì)胞脂代謝之間的關(guān)系。
　　【方法】
　　1.構(gòu)建攜帶HA-HCVcore3a和HA-HCVcore1b融合基因的重組腺病毒；
　　2.通過原位灌注分離小鼠原代肝細(xì)胞培養(yǎng)，并制作細(xì)胞爬片；
　　3.用攜帶融合基因HA-HCVcore3a和HA-HCVcore1b的重組腺病毒感染小鼠原代肝細(xì)胞；
　　4.在

9、24h，48h，72h的時間點(diǎn)分別對原代肝細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光檢測，觀察原代肝細(xì)胞中脂滴形成的大小，數(shù)量等形態(tài)學(xué)特點(diǎn)；
　　5.培養(yǎng)小鼠肝細(xì)胞系A(chǔ)ML12，并進(jìn)行重組腺病毒的感染；
　　6.反轉(zhuǎn)錄受感染細(xì)胞中的mRNA為cDNA，進(jìn)行實時定量PCR檢測，以探究HCVcore蛋白在肝細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)脂肪變的分子機(jī)制。
　　【結(jié)果】
　　1.成功構(gòu)建pAdEasy-HA-HCVcore3a和pAdEasy-HA-HCVcore

10、1b重組腺病毒。
　　首先將全基因合成的HCVcore3a(1b)片段連入pCMV-HA載體中，并將HA-HCVcore3a(1b)片段整體轉(zhuǎn)入穿梭質(zhì)粒pshuttle-CMV中。利用穿梭質(zhì)粒同源重組獲得重組腺病毒質(zhì)粒，經(jīng)腺病毒包裝和擴(kuò)增獲得高滴度的重組腺病毒。利用westernblot技術(shù)檢測融合蛋白鑒定重組腺病毒包裝成功。
　　2.相對于HCVcore1b，感染HCVcore3a重組腺病毒的小鼠原代肝細(xì)胞形成的脂滴增大，

11、數(shù)量增加。
　　用pAdEasy-HA-HCVcore3a和pAdEasy-HA-HCVcore1b重組腺病毒感染小鼠原代肝細(xì)胞24h，48h，72h。結(jié)果顯示，pAdEasy-HA-HCVcore3a與pAdEasy-HA-HCVcore1b感染相比，前者能夠誘導(dǎo)形成體積較大的脂滴，并且脂滴數(shù)量明顯增加。HCVcore1b與正常肝細(xì)胞相比也能誘導(dǎo)數(shù)量較少的脂肪變。
　　3.感染pAdEasy-HA-HCVcore3a重組腺

12、病毒的小鼠肝細(xì)胞中PPAR-α的mRNA的表達(dá)量明顯低于pAdEasy-HA-HCVcore1b感染的肝細(xì)胞以及正常原代肝細(xì)胞，同時ACC1表達(dá)量有所升高，但FAS的表達(dá)量變化不明顯。
　　用pAdEasy-HA-HCVcore3a和pAdEasy-HA-HCVcore1b分別感染小鼠肝細(xì)胞系A(chǔ)ML12。24h后利用實時定量PCR技術(shù)檢測PPAR-α，ACC1和FAS的mRNA含量。發(fā)現(xiàn)3a亞型感染與1b亞型感染和正常細(xì)胞相比，P

13、PAR-α的表達(dá)量明顯降低。而ACC1表達(dá)量有所升高，但亞型之間相差不大，而FAS的mRNA的表達(dá)量變化不大。
　　【結(jié)論】本研究發(fā)現(xiàn)HCVcore3a在細(xì)胞水平上誘導(dǎo)肝臟細(xì)胞脂肪變的作用比HCVcore1b更強(qiáng)。在脂滴大小和數(shù)量上都可以明顯地看出此趨勢，其中HCVcore3a組脂滴大小為HCVcore1b組脂滴大小的4～6倍。HCVcore蛋白可能通過降低宿主細(xì)胞PPAR-α等相關(guān)蛋白的表達(dá)量發(fā)生作用，誘導(dǎo)脂滴形成，誘發(fā)肝臟脂肪