換錦花F3’H和MYB4同源基因的克隆與表達分析.pdf

1、石蒜屬植物在我國資源豐富,天然分布最多且最廣。石蒜屬植物因其豐富的花色、花型,被譽為“中國的郁金香”,其觀賞價值在園林和園藝上有重要的意義。換錦花的花色具有特殊性,即紫紅色的花瓣以及花瓣尖端帶有藍色,為研究換錦花特殊的顏色形成機理,本研究以換錦花的花瓣為材料,通過RT-PCR和 RACE技術(shù)相結(jié)合的方法獲得換錦花花色形成相關(guān)的LsF3’H基因和LsMYB4基因,同時利用分子生物和生物信息學的方法分析其核苷酸序列以及編碼的氨基酸序列,并利

2、用熒光定量 PCR技術(shù)對換錦花在花發(fā)育不同時期、不同組織器官以及花色存在差異不同無性系中的表達模式,來分析這些基因在換錦花花色形成中的功能和作用;通過構(gòu)建過表達載體,利用異源轉(zhuǎn)化的方法進一步驗證和分析研究LsF3’H基因和LsMYB4基因?qū)Q錦花花色素苷生物合成的作用。主要的研究結(jié)果如下:
　　(1)通過 NCBI搜索同源基因,并設(shè)計簡并引物克隆到換錦花 LsF3’H基因和LsMYB基因片段;并結(jié)合 RACE技術(shù)獲得長1587 b

3、p的 LsF3’H基因和793bp的LsMYB4基因cDNA全長序列;對其進行生物信息學分析結(jié)果表明LsF3’H具細胞色素P450的特異結(jié)構(gòu)域,LsMYB4具有R2R3-MYB高度保守的特異結(jié)構(gòu),并對其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進行預(yù)測,在多序列比對的基礎(chǔ)上,構(gòu)建了系統(tǒng)進化樹,對其進化關(guān)系進行分析,其分類和植物分類學基本一致,得出LsF3’H屬于CYP75亞家族,LsMYB4和擬南芥亞群AtMYB4相似度最高。
　　(2)利用熒光定量PCR分析換

4、錦花中的LsF3’H和LsMYB4基因的表達,結(jié)果表明,LsF3’H和LsMYB4基因的表達均具有組織特異性,LsF3’H基因在不同組織和不同花發(fā)育時期均有表達,而且在花瓣中的相對表達量比葉多10倍,在盛花期的相對表達量比花苞期高70倍。在換錦花不同花色的無性系中表達存在差異,花色較淺的換錦花無性系相對表達量高于其它無性系;LsMYB4花瓣中的相對表達量比葉多9-10倍,在盛花期的相對表達量比花苞期多20倍。不同花色的無性系中表達存在差

5、異,花色較淺的換錦花無性系相對表達量高于其它無性系,可以推測LsMYB4基因在調(diào)控換錦花花色形成的過程中起著負調(diào)控的作用。
　　(3)通過雙酶切的方法構(gòu)建LsF3’H和LsMYB4基因的過表達載體,并利用農(nóng)桿菌介導法進行煙草轉(zhuǎn)化,共獲得轉(zhuǎn)基因陽性植株19株,并通過PCR進一步驗證,表明煙草植株確定為轉(zhuǎn)基因LsF3’H和LsMYB4基因的煙草,但對于LsF3’H和LsMYB4基因的過表達對煙草的花色素苷合成的影響和作用有待進一步研究