血管內(nèi)皮抑素協(xié)同腫瘤特異性DC-T細胞的抗腫瘤效應及其機制探討.pdf

1、近年來，惡性腫瘤已成為全球主要的公共衛(wèi)生問題，對于大多數(shù)腫瘤患者，手術(shù)、化療和放療等傳統(tǒng)治療未能有效控制病情。作為一種新興的治療模式，細胞免疫治療能夠有效控制某些化放療失敗的腫瘤，但總體而言其臨床有效率仍然偏低。目前腫瘤生物治療研究的熱點之一就是尋找具有較強靶向性的、安全有效的腫瘤聯(lián)合治療新模式，以提高細胞免疫治療惡性腫瘤的有效性。
　　血管新生是腫瘤的基本生物學特征，靶向腫瘤的血管新生是一種有良好前景的控制腫瘤生長的治療策略。研

2、究證實單獨使用抗血管新生藥物不能帶來長期的生存獲益，聯(lián)合細胞免疫治療可能獲得持續(xù)性的腫瘤消退，這提示抗血管新生藥物與細胞免疫治療有協(xié)同效應。血管內(nèi)皮抑素(Endostatin)被認為是一種沒有毒副作用且不易耐藥的、有潛力的抗血管新生藥物。但迄今為止，Endostatin對細胞免疫治療抗腫瘤效應的影響尚不清楚，上述的協(xié)同效應能否延伸到Endostatin還需明確。Endostatin與細胞免疫治療聯(lián)合應用的研究將為抗腫瘤效應強大而持久的發(fā)

3、揮提供新的視角。
　　炎性微環(huán)境是腫瘤的主要構(gòu)成特征，對于細胞免疫治療的成敗起決定性作用，其通過MDSC等多種抑制性因素使回輸?shù)臍訲細胞轉(zhuǎn)換為抑制性調(diào)節(jié)T細胞(Treg)。此外，腫瘤微環(huán)境內(nèi)的骨髓來源抑制細胞(MDSC)、腫瘤相關(guān)巨噬細胞(TAM)、未成熟樹突狀細胞因子(imDC)等免疫細胞及促炎細胞因子（IL-6、IL-17、TNF-α及趨化因子等）能通過刺激血管新生和組織重構(gòu)促進腫瘤發(fā)展，并形成腫瘤微環(huán)境內(nèi)抑制性的免疫狀態(tài)

4、。新近研究證實抗血管新生藥物Sunitinib可減少腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制性細胞(MDSC、Treg)的數(shù)量、下調(diào)抑制性細胞因子[IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β]和程序性死亡受體-1(PD-1)的表達，緩解與腫瘤相關(guān)的免疫抑制，促進腫瘤特異性TIL細胞在腫瘤組織內(nèi)的浸潤。但至今Endostatin對腫瘤微環(huán)境內(nèi)免疫狀態(tài)及對過繼免疫細胞抗腫瘤效應的影響及機制尚未明確。本課題通過Lewis肺癌荷瘤鼠模型，研究Endostatin在發(fā)

5、揮抗腫瘤效應過程中對腫瘤微環(huán)境內(nèi)免疫網(wǎng)絡(luò)的影響，進一步明確Endostatin抗腫瘤效應的具體機制，從而為開展抗血管新生的分子靶向治療與細胞免疫治療的聯(lián)合尋找理論依據(jù)。
　　精確評估抗血管新生治療后腫瘤微環(huán)境的改變對于明確其具體的抗腫瘤效應、優(yōu)化治療策略是十分重要的。腫瘤微環(huán)境中的炎性介質(zhì)與促血管新生因子之間存在密切關(guān)系。其中，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素-6(IL-6)是腫瘤微環(huán)境內(nèi)重要的促血管新生炎性細胞因子，在調(diào)節(jié)

6、免疫細胞、促進血管新生中發(fā)揮重要作用。TNF-α驅(qū)動的CXC趨化因子(CXCLs)與其受體（CXCR2）軸通路在肺損傷所致的血管新生中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)非小細胞肺癌(NSCLC)患者血清中TNF-α的水平較健康人群顯著升高。IL-6主要通過轉(zhuǎn)錄信號傳導子與激活子3（STAT3）信號通路促進VEGF的轉(zhuǎn)錄、內(nèi)皮細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，從而在多種實體瘤的腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮促血管新生的作用。目前國際上已有關(guān)于TNF-α和IL-6基因多態(tài)性與疾病的

7、相關(guān)性研究。在本課題的工作中，我們探討了腫瘤微環(huán)境中的TNF-α和IL-6基因型與肺癌發(fā)生的相關(guān)性，以進一步論證腫瘤微環(huán)境促血管新生的炎性因子與肺癌發(fā)生的關(guān)系，并為深入研究Endostatin抗腫瘤效應的主要作用靶點及機制提供新的線索。
　　為了刺激血管新生，腫瘤上調(diào)了一系列與血管新生相關(guān)的因子，這些發(fā)現(xiàn)為抗血管新生治療的發(fā)展提供了理論基礎(chǔ)。近年來，國際上抗血管新生的機制研究主要集中于VEGF及其受體通路，VEGF-A和其受體VE

8、GFR-2是抗血管新生藥物的關(guān)鍵靶點。而有關(guān)Endostatin抗血管新生的作用靶點及其機制的研究少有。一項對人類90％基因組的分析結(jié)果揭示Endostatin下調(diào)了微血管內(nèi)皮細胞的調(diào)節(jié)血管生成因子的信號通路，包括VEGF、乏氧誘導因子-1α(HIF-1α)、腫瘤壞死因子受體(TNFR)等。這一研究提示Endostatin是一種多靶點的抗血管新生藥物。鑒于腫瘤微環(huán)境內(nèi)的免疫細胞、細胞因子及趨化因子在腫瘤血管新生中發(fā)揮的重要作用，使其成為

9、抗血管新生治療的理想靶點。本課題以腫瘤微環(huán)境中的TNF-α、IL-6或其受體、信號通路下游因子等作為主要靶目標，采用蛋白芯片技術(shù)篩選Endostatin抗腫瘤效應的主要作用靶點，進一步明確Endostatin與免疫系統(tǒng)間的相互作用，有望為合理設(shè)計抗血管新生的靶向藥物Endostatin與細胞免疫治療聯(lián)合的最佳模式（應用順序、時間及劑量）提供理論和實驗基礎(chǔ)。
　　總之，本課題組前期成功獲得Lewis肺癌腫瘤抗原特異性的DC-T細胞，

10、并經(jīng)流式細胞術(shù)分析其細胞亞群主要為細胞毒性的CD8+T細胞。在此基礎(chǔ)上，本課題研究了Endostatin對腫瘤特異性DC-T細胞抗腫瘤效應的影響，進而探求其對腫瘤微環(huán)境內(nèi)的免疫網(wǎng)絡(luò)的作用，以明確Endostatin與細胞免疫治療的聯(lián)合抗腫瘤的效應機制;從遺傳多態(tài)性的角度，探討腫瘤微環(huán)境的重要促血管新生炎性因子TNF-α和IL-6的基因型與中國北方漢族人群肺癌發(fā)生的相關(guān)性;進而以TNF-α和IL-6及其受體、信號通路下游因子為主要靶目標，

11、利用蛋白芯片篩選Endostatin抗腫瘤效應的主要作用靶點，為合理設(shè)計抗血管新生的Endostatin與細胞免疫治療聯(lián)合的最佳模式提供了理論和實驗基礎(chǔ)。
　　第一部分:血管內(nèi)皮抑素協(xié)同腫瘤特異性DC-T細胞的抗腫瘤效應
　　目的:探討血管內(nèi)皮抑素(Endostatin)對腫瘤特異性DC-T細胞抗腫瘤效應的影響。
　　方法:
　　1.建立Lewis肺癌C57BL/6鼠移植瘤模型，設(shè)DC-T組、DC-T+Endos

12、tatin組及PBS對照組，每組均設(shè)C57BL/6鼠7只，小鼠種瘤后第7天開始給予治療干預，第14天給藥后24小時處死小鼠;隔日觀察腫瘤生長情況、測量瘤徑，并繪制腫瘤生長曲線;
　　2.DC-T+Endostatin組中，每只C57BL/6鼠給予重組人血管內(nèi)皮抑素（rhEndostatin，Simcere公司）15mg/Kg/d，經(jīng)鼠尾靜脈注射，共14天;
　　3.取健康C57BL/6小鼠抗凝靜脈血，采用Ficoll梯度離心

13、法分離外周血單個核細胞(PBMC)，尼龍毛柱法分離得到T淋巴細胞，將培養(yǎng)5天的DC細胞與Lewis肺癌細胞株反復凍融所獲得的腫瘤抗原共同孵育3天，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)第9天的T淋巴細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，再共同培養(yǎng)24小時，所獲得的細胞即為腫瘤特異性DC-T細胞，經(jīng)流式細胞分析驗證其主要的細胞亞群;
　　4.DC-T組及DC-T+Endostatin組中，每只C57BL/6鼠于種瘤后第7天，給予腫瘤特異性DC-T細胞5×106個，經(jīng)鼠尾靜脈輸注，共1次

14、;
　　5.分離小鼠體內(nèi)的腫瘤組織，觀察腫瘤組織內(nèi)的壞死情況，檢測各組腫瘤組織微血管密度(MVD)評價血管新生情況;
　　6.Western blot、免疫組化分別檢測各組腫瘤組織內(nèi)VEGF和HIF-1α蛋白表達;
　　7.制備腫瘤組織單細胞懸液，流式細胞術(shù)檢測各組腫瘤組織細胞懸液內(nèi)CD8+T、mDC、TAM(M1/M2)和MDSC等細胞的比例;
　　8.酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測腫瘤組織細胞懸液中IL-

15、6、IL-10、IL-17、TGF-β及干擾素-γ（INF-γ）等細胞因子表達。
　　結(jié)果:
　　1.相較于對照組，腫瘤特異性DC-T細胞組有效抑制腫瘤生長(P=0.021);腫瘤特異性DC-T細胞聯(lián)合Endostatin治療較對照組顯著抑制了腫瘤的生長(P=0.009)。免疫組化檢測顯示，腫瘤特異性DC-T細胞治療組的腫瘤組織內(nèi)微血管密度(MVD)少于對照組(P=0.027);而腫瘤特異性DC-T細胞聯(lián)合Endostati

16、n治療組腫瘤組織的MVD顯著減少(P=0.002)，腫瘤組織壞死明顯增加;
　　2.Western blot檢測顯示，相較于對照組，腫瘤特異性DC-T細胞治療使腫瘤組織內(nèi)的VEGF蛋白表達明顯下降(P=0.002)，且HIF-1α蛋白表達增加(P=0.000);而腫瘤特異性DC-T細胞聯(lián)合Endostatin治療組VEGF表達顯著下降(P=0.000)，HIF-1α蛋白表達明顯增加(P=0.000);免疫組化染色結(jié)果支持了上述變化

17、。ELISA檢測顯示，相較于對照組，腫瘤特異性DC-T細胞治療使腫瘤組織內(nèi)的促血管新生因子IL-6、IL-17表達明顯減少（P值分別為0.026，0.044），而抑制血管新生的IFN-γ表達增加(P=0.026);腫瘤特異性DC-T細胞聯(lián)合Endostatin治療使IL-6、IL-17顯著減少(P值分別為0.008，0.01)，而IFN-γ表達明顯增加(P=0.009);
　　3.流式細胞分析顯示，相較于對照組，DC-T細胞治療使

18、腫瘤組織內(nèi)免疫抑制性細胞MDSC(P=0.03)比例下降，TAM細胞的免疫增強M1型升高(P=0.045)而免疫抑制性的M2型下降(P=0.038);腫瘤特異性DC-T細胞聯(lián)合Endostatin治療更顯著地減少腫瘤組織內(nèi)MDSC(P=0.009)和M2型TAM明顯下降(P=0.008)，M1型TAM細胞顯著增加(P=0.005)。DC-T細胞治療單獨較對照組增加了腫瘤組織內(nèi)mDC(P=0.038)和CD8+T細胞的浸潤(P=0.019

19、);腫瘤特異性DC-T細胞聯(lián)合Endostatin治療顯著上調(diào)mDC比例(P=0.005)，明顯增加腫瘤組織內(nèi)CD8+T細胞的浸潤(P=0.008);
　　4.ELISA檢測進一步證實了流式細胞分析的結(jié)果，相較于對照組，DC-T細胞治療單獨應用下調(diào)了腫瘤組織內(nèi)的免疫抑制性細胞因子IL-6、IL-10、TGF-β和IL-17(P值分別為0.026，0.032，0.029，0.044)，增加了參與溶瘤作用的IFN-γ表達(P=0.02

20、6);腫瘤特異性DC-T細胞聯(lián)合Endostatin治療較PBS對照更顯著地下調(diào)腫瘤組織內(nèi)的IL-6、IL-10、TGF-β和IL-17表達（P值分別為0.008，0.008，0.002，0.01），IFN-γ表達明顯增加(P=0.009)。
　　結(jié)論:
　　1.腫瘤特異性DC-T細胞聯(lián)合Endostatin治療顯著地減少了腫瘤組織內(nèi)的血管結(jié)構(gòu)，強力抑制腫瘤血管新生，明顯減緩腫瘤生長，并促進了腫瘤壞死;
　　2.兩種治

21、療的聯(lián)合顯著抑制了多種促血管新生因子表達，并上調(diào)抑制血管新生因子的表達，同時使HIF-1α蛋白表達顯著增加，加劇了腫瘤組織內(nèi)的低氧狀態(tài);
　　3.腫瘤特異性DC-T細胞聯(lián)合Endostatin治療顯著地抑制了腫瘤組織內(nèi)的免疫抑制性的MDSC和M2型TAM細胞比例，上調(diào)了免疫增強的M1型TAM比例，并使腫瘤組織內(nèi)成熟DC和CD8+T細胞浸潤明顯增加，逆轉(zhuǎn)了腫瘤微環(huán)境的免疫抑制;
　　4.兩種治療聯(lián)合顯著地下調(diào)了腫瘤組織內(nèi)免疫抑

22、制性的IL-6、IL-10、TGF-β和IL-17表達，增加了參與溶瘤作用的IFN-γ表達，進一步支持了Endostatin協(xié)同腫瘤特異性DC-T細胞治療在強力抑制血管新生和腫瘤生長的同時，有效逆轉(zhuǎn)腫瘤微環(huán)境的免疫抑制，使腫瘤細胞更易被抗腫瘤免疫反應損傷。
　　第二部分:血管內(nèi)皮抑素有效糾正肺癌炎性腫瘤微環(huán)境的免疫抑制
　　目的:探討Endostatin對肺癌腫瘤微環(huán)境內(nèi)的免疫抑制細胞及相關(guān)細胞因子的影響。
　　方法:

23、
　　1.建立Lewis肺癌C57BL/6鼠移植瘤模型，分為對照組、低劑量Endostatin、高劑量Endostatin三組，每組均設(shè)C57BL/6鼠7只。對照組給予PBS0.2ml/只/天，低劑量Endostatin組給予rhEndostatin7.5mg/Kg/d，高劑量Endostatin組給予rhEndostatin 15mg/Kg/d，三組均于小鼠種瘤第7日開始給予治療干預，均為經(jīng)鼠尾靜脈注射藥物，治療共14天。第14

24、天給藥后24小時處死荷瘤鼠。隔日觀察腫瘤生長情況、測量瘤徑，繪制腫瘤生長曲線;
　　2.分離小鼠體內(nèi)的腫瘤組織，觀察腫瘤組織內(nèi)的壞死情況，檢測腫瘤組織MVD，評價腫瘤血管新生;
　　3.Western blot、免疫組化分別檢測各組腫瘤組織內(nèi)VEGF和HIF-1α蛋白表達;
　　4.制備腫瘤組織單細胞懸液，流式細胞術(shù)檢測各組腫瘤組織細胞懸液內(nèi)CD8+T、mDC、TAM(M1/M2)和MDSC等細胞的比例;
　　5

25、.ELISA檢測各組腫瘤組織細胞懸液中IL-6、IL-10、IL-17、TGF-β和IFN-γ等細胞因子的表達。
　　結(jié)果:
　　1.相對于對照組，EndoStatin使腫瘤生長明顯受抑(P=0.013)，且低劑量與高劑量Endostatin組間無明顯差別（P＞0.05）。免疫組化檢測顯示，CD31作為血管內(nèi)皮細胞的標記，內(nèi)皮細胞胞漿被染為黃棕色。低劑量Endostatin使腫瘤組織內(nèi)微血管密度(MVD)較對照組明顯減少(P

26、=0.014);高劑量Endostatin組腫瘤組織的MVD顯著減少(P=0.002)，腫瘤壞死明顯增加;且低劑量與高劑量Endostatin組間存在明顯差別(P＜0.05);
　　2.Western blot檢測顯示，相較于對照組，低劑量Endosattin治療使腫瘤組織內(nèi)的VEGF蛋白表達明顯下降(P=0.001)，且HIF-1α蛋白表達增加（P=0.000）;而高劑量Endostatin治療組VEGF表達顯著下降(P=0.0

27、00)，HIF-1α蛋白表達明顯增加（P=0.001）;免疫組化染色結(jié)果支持了上述變化。ELISA檢測顯示，相較于對照組，低劑量Endosattin治療使腫瘤組織內(nèi)的促血管新生因子IL-6、IL-17表達明顯減少（P值分別為0.022，0.038），而抑制血管新生的IFN-γ表達增加（P=0.044）;而高劑量Endostatin治療組IL-6、IL-17顯著減少（P值分別為0.012，0.029），而IFN-γ表達明顯增加(P=0.0

28、36)。而低劑量與高劑量Endostatin組之間的上述變化無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）;
　　3.流式細胞分析顯示，相較于對照組，低劑量Endosattin治療使腫瘤組織內(nèi)免疫抑制性細胞MDSC(P=0.035)和M2型TAM(P=0.042)比例下降，免疫增強的M1型TAM升高(P=0.031);高劑量Endostatin治療更顯著地減少了腫瘤組織內(nèi)MDSC(P=0.019)和M2型TAM（P=0.013），而M1型TAM顯著

29、增加(P=0.017)。低劑量Endosattin治療較對照增加了腫瘤組織內(nèi)mDC(P=0.034)和CD8+T細胞的浸潤（P=0.038）;高劑量Endostatin治療顯著上調(diào)mDC比例(P=0.018)，明顯增加腫瘤組織內(nèi)CD8+T細胞的浸潤(P=0.017)。而低劑量與高劑量Endostatin組間的上述變化無顯著差異(P＞0.05);
　　4.ELISA檢測進一步證實了流式細胞分析的結(jié)果，相較于PBS對照，低劑量Endo

30、statin治療后荷瘤鼠腫瘤組織內(nèi)的免疫抑制性細胞因子IL-6、IL-10、IL-17及TGF-β表達明顯下降（P值分別為0.022，0.020，0.038，0.018），增加了參與溶瘤作用的IFN-γ表達(P=0.044);高劑量Endostatin治療更顯著地下調(diào)腫瘤組織內(nèi)的IL-6、IL-10、TGF-β和IL-17表達(P值分別為0.012，0.018，0.014，0.029)，IFN-γ表達明顯增加(P=0.036)。而低劑量

31、與高劑量Endostatin組間的上述變化無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.Endostatin以劑量依賴模式顯著地抑制腫瘤血管新生，促進腫瘤壞死，從而強力抑制腫瘤的生長;
　　2.Endostatin通過抑制腫瘤組織內(nèi)多種促血管新生因子的表達，上調(diào)抑制血管新生因子的表達，并使HIF1α蛋白表達明顯增加，加劇了腫瘤組織內(nèi)的低氧狀態(tài);
　　3.Endostatin通過下調(diào)腫瘤微環(huán)境內(nèi)免疫抑制性細胞

32、MDSC和M2型TAM的比例，上調(diào)了免疫增強的M1型TAM細胞比例，并使腫瘤組織內(nèi)成熟DC和CD8+T細胞浸潤明顯增加，有效糾正腫瘤微環(huán)境的免疫抑制;
　　4.Endostatin使腫瘤組織內(nèi)的多種免疫抑制性細胞因子表達減少，同時增加了參與溶瘤作用的IFN-γ表達，進一步支持Endostatin可有效改善腫瘤微環(huán)境的免疫抑制，從而發(fā)揮協(xié)同DC-T細胞治療的抗腫瘤效應。
　　第三部分:促炎細胞因子TNF-α和IL-6的基因多態(tài)

33、性與肺癌的發(fā)生相關(guān)
　　目的:研究促炎細胞因子TNF-α和IL-6的基因啟動子區(qū)多態(tài)性與肺癌發(fā)生的相關(guān)性。
　　方法:
　　1.提取中國北方地區(qū)漢族人群中138例肺癌患者（肺癌組）和138位健康人（對照組）外周血基因組總DNA，兩組的年齡和性別分布無統(tǒng)計學差異(P＞0.05);
　　2.用PCR方法分別擴增TNF-α基因啟動子區(qū)-238G位點和IL-6基因啟動子區(qū)-572C位點的片段;
　　3.PCR擴增T

34、NF-α基因位點的產(chǎn)物片段約290個堿基對，采用BglⅡ酶進行酶切以明確-238G位點是否發(fā)生了G-to-A單堿基轉(zhuǎn)換;
　　4.PCR擴增IL-6基因位點的產(chǎn)物片段約400堿基對，采用BsrBI酶進行酶切以明確-572C位點是否發(fā)生了C-to-G單堿基轉(zhuǎn)換;
　　5.以x2-Test驗證基因型頻率是否符合與Hardy-Weinberg平衡定律，采用非條件Logistic回歸校正混雜因素，行多態(tài)性與肺癌風險關(guān)聯(lián)性的統(tǒng)計學分析

35、。
　　結(jié)果:
　　1.TNF-α基因-238G位點的單核苷酸多態(tài)性(SNP)檢測
　　兩組276例含290堿基對片段的PCR擴增產(chǎn)物，經(jīng)BglⅡ酶切產(chǎn)生了三種條帶型，分別為80、210和290堿基對條帶。由于酶BglⅡ識別AGATCT，-238G位點發(fā)生單堿基G-to-A轉(zhuǎn)換產(chǎn)生80和210堿基對條帶，生成一個BglⅡ酶切位點。RFLP結(jié)果提示TNF-α基因-238位點有三種SNP基因型，這三種多態(tài)性包括無轉(zhuǎn)換、兩個

36、等位基因-238G位點都有一個單堿基G-to-A轉(zhuǎn)換、等位基因中的一個基因-238G位點有一個單堿基G-to-A轉(zhuǎn)換，即分別為野生型（wt），G-A/G-A和G-A基因型。
　　2.IL-6基因-572C位點的SNP檢測
　　兩組276例含400堿基片段的PCR擴增產(chǎn)物，經(jīng)BsrBI酶切產(chǎn)生了三種條帶型分別為150、250和400堿基對條帶。由于酶BsrBI識別CCGCTC，-572C位點發(fā)生了單堿基C-to-G轉(zhuǎn)換產(chǎn)生15

37、0和250堿基對條帶，生成一個BsrBI酶切位點。RFLP結(jié)果提示IL-6基因-572C位點有三種SNP基因型，這三種多態(tài)性包括無轉(zhuǎn)換、兩個等位基因-572C位點都有一個單堿基C-to-G轉(zhuǎn)換、等位基因中的一個基因-572C位點有一個單堿基C-to-G轉(zhuǎn)換，即分別為野生型(wt)，G-A/G-A和G-A基因型。
　　3.TNF-α基因-238G位點單堿基G-to-A轉(zhuǎn)換的高頻率分布與肺癌的發(fā)生相關(guān)
　　對TNF-α基因-23

38、8G位點的SNP進行統(tǒng)計學分析，證實兩個等位基因-238GSNP的基因頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(P＞0.05)。大多數(shù)的病例具有-238G位點的野生型(wt)SNP（對照組113例，肺癌組99例）;對照組和肺癌組有相同數(shù)量的G-A基因型，對照組有2例G-A/G-A基因型，而肺癌組有14例G-A/G-A基因型。肺癌組G-ASNP數(shù)量的增加提示兩個等位基因上G-ASNP與肺癌的發(fā)生相關(guān)(P=0.005，OR=1.74

39、395％CI0.232-0.682)。
　　4.IL-6基因-572C位點單堿基C-to-G轉(zhuǎn)換的高頻率分布與肺癌的發(fā)生相關(guān)
　　對IL-6基因-572C位點的SNP進行統(tǒng)計學分析，證實兩個等位基因-572C位點SNPs的基因頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡定律（P＞0.05）。在IL-6基因-572C位點的SNP，對照組和肺癌組有相同數(shù)量的野生型（wt）或C-GSNP，而對照組有3例C-G/C-G基因型，肺癌組

40、有9例C-G/C-G基因型。肺癌組C-G/C-GSNP數(shù)量的增加提示兩個等位基因上純合型C-G/C-GSNP與肺癌的發(fā)生相關(guān)(P=0.029,OR=1.23495％CI1.412-2.727)。
　　結(jié)論:
　　1.腫瘤微環(huán)境中重要的促血管新生炎性因子TNF-α和IL-6的基因多態(tài)性是中國北方漢族人群肺癌遺傳易感性的關(guān)鍵因素;
　　2.TNF-α基因啟動子區(qū)-238G位點單堿基G-to-A轉(zhuǎn)換和IL-6基因啟動子區(qū)-5

41、72C位點單堿基C-to-G轉(zhuǎn)換的高頻率分布與肺癌的發(fā)生相關(guān)。
　　第四部分:趨化因子CXCL1-2/CXCR2軸通路參與血管內(nèi)皮抑素的抗腫瘤效應
　　目的:采用蛋白芯片技術(shù)篩選Endostatin抗腫瘤效應的主要作用靶點。
　　方法:
　　1.建立Lewis肺癌C57BL/6鼠移植瘤模型，設(shè)對照組和實驗組，每組均設(shè)C57BL/6小鼠7只，于小鼠種瘤后第7天開始給予治療干預，對照組給予PBS0.2ml/只/天，實

42、驗組給予rhEndostatin 15mg/Kg/d，均經(jīng)鼠尾靜脈注射給藥，治療共14天。第14天末次治療后24小時處死小鼠;
　　2.分離小鼠體內(nèi)的腫瘤組織，取各組腫瘤組織塊行蛋白芯片檢測。檢測項目包括CCL11、CCL2、CCL3、GM-CSF、IFN-γ、IL-12p70、IL-2、IL-4、IL-6、IL-9、CXCL1、CXCL2、MCP5、SCF、sTNFR1、TIMP1和VEGF-A等19種促/抗血管新生因子。統(tǒng)計學

43、分析采用Significance Analysis of Microarrays(SAM)基因芯片分析軟件;
　　3.將對照組和實驗組的樣本量均擴大一倍，并重復上述實驗，經(jīng)處理后留取腫瘤組織行蛋白芯片檢測。并根據(jù)第一次篩選的結(jié)果調(diào)整檢測項目。統(tǒng)計學分析采用Significance Analysis of Microarrays(SAM)基因芯片分析軟件，并將腫瘤樣品的蛋白芯片檢測結(jié)果進行聚類分析。
　　結(jié)果:
　　1.

44、初次實驗中蛋白芯片雜交圖和SAM分析結(jié)果顯示，腫瘤組織內(nèi)趨化因子CXCL1和CXCL2、CCL3的水平顯著升高（分別為4.1倍，2.4倍，2.3倍），而VEGF-A、GM-CSF、sTNFR1/2、TIMP1等重要的促/抗血管新生因子的水平未發(fā)生明顯變化;
　　2.根據(jù)第一次篩選的結(jié)果調(diào)整檢測項目，包括GM-CSF、CCL27、CXCL1、CXCL2、IL-2、MCP5、sTNFR1、TIMP1和VEGF-A等9種促/抗血管新生因

45、子。重復實驗中蛋白芯片雜交圖和SAM分析結(jié)果顯示，腫瘤組織內(nèi)的趨化因子CXCL2水平仍呈顯著升高，同時VEGFA、GM-CSF亦明顯升高（分別為1.964倍，1.505倍，2.18倍），聚類分析結(jié)果驗證了上述因子的變化趨勢。
　　結(jié)論:
　　1.腫瘤微環(huán)境內(nèi)的多個促血管新生因子在Endostatin治療后發(fā)生顯著變化，證實了Endostatin具有多靶點抗血管新生的特征;
　　2.除了VEGF信號通路，腫瘤微環(huán)境內(nèi)的趨