膠質(zhì)瘤中miR-106b～25的表達(dá)及生物學(xué)作用機制的研究.pdf

1、作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的難治性腫瘤，膠質(zhì)瘤的治療一直是神經(jīng)外科的難題之一。在過去的幾十年里，盡管膠質(zhì)瘤的診療方法一直在不斷改善，然而卻成效甚微。從分子水平來全面理解膠質(zhì)瘤的發(fā)生進展的機理，并在此基礎(chǔ)上尋求有效的防治方法依然是當(dāng)前膠質(zhì)瘤研究的重點和難點。近年來的大量研究均顯示出非編碼。RNA在多種生物學(xué)過程中具有重要調(diào)控作用。微RNA(microRNA，miRNA)是非編碼RNA家族中被研究得最多的成員。目前，已經(jīng)在多種疾病中發(fā)現(xiàn)異常的m

2、iRNA表達(dá)譜，尤其腫瘤。多種miRNA都在腫瘤的發(fā)生發(fā)展的過程中起著原癌或抑癌樣的作用。尋找異常表達(dá)的miRNA并探索其功能可為腫瘤的診療提供新的分子標(biāo)簽及靶點。
　　我們之前對6個膠質(zhì)瘤細(xì)胞系進行了microRNA表達(dá)譜研究，miR-106b是8個上調(diào)的miRNA之一。miR-106b與miR-93、-25共同組成了miR-106b～25基因簇。該基因簇與miR-17～92原癌基因簇為旁系同源。目前研究發(fā)現(xiàn)miR-106b～2

3、5基因簇的三個成員在多種腫瘤組織及腫瘤細(xì)胞系中都高表達(dá)，包括頭頸部鱗癌、結(jié)腸癌、髓母細(xì)胞瘤、食管癌、多發(fā)性骨髓瘤、肝癌等，并且可以通過調(diào)控細(xì)胞周期、凋亡相關(guān)蛋白影響腫瘤細(xì)胞的生長和存活。miR-106b～25基因簇在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及功能目前研究報道得還很少。
　　在第一部分研究中，我們分別運用原位雜交和實時定量PCR的方法檢測了包含正常腦組織和不同級別膠質(zhì)瘤的組織芯片及手術(shù)新鮮切除的不同級別膠質(zhì)瘤標(biāo)本中miR-106b～25的表達(dá)

4、。結(jié)果顯示miR-106b～25的三個成員在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)高于瘤旁正常腦組織，并隨著腫瘤級別增高，三種miRNA的表達(dá)呈增高趨勢。8種膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中miR-106b～25的表達(dá)結(jié)果表明，該簇小RNA在體外培養(yǎng)的細(xì)胞系中表達(dá)也不同程度地增高。這些結(jié)果均顯示miR-106b～25在膠質(zhì)瘤中表達(dá)增高，并同腫瘤級別呈正相關(guān)，顯示出其在膠質(zhì)瘤的發(fā)展過程中可能發(fā)揮著一定的作用。三種miRNA的定量表達(dá)的相關(guān)性分析結(jié)果表明三種miRNA的表達(dá)具

5、有明顯相關(guān)性，可能存在協(xié)同轉(zhuǎn)錄。
　　第二部分研究中我們運用miR-106b、-93、-25的反義寡核苷酸作為抑制劑，在U251、LN229及TJ905膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中驗證了miR-106b、-93、-25對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性的影響及可能的機制。三種miRNA對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為的調(diào)控作用既有協(xié)同作用，也在某些方面存在不同的作用。在細(xì)胞生長能力方面，單獨抑制每個miRNA和聯(lián)合抑制均可以導(dǎo)致膠質(zhì)瘤細(xì)胞的周期阻滯、生長減

6、慢、錨定非依賴性生長能力減弱，單獨抑制與聯(lián)合作用效果相似。但作用機制卻存在差異，miR-106b、-93主要通過靶向p21抑制細(xì)胞周期進展而對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長呈抑制作用，不影響細(xì)胞凋亡，而miR-25主要通過靶向p57和Bim分別參與細(xì)胞周期和凋亡過程的調(diào)控來抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長。細(xì)胞侵襲能力檢測結(jié)果顯示抑制miR-106b、-93的表達(dá)可以明顯抑制MMP2的表達(dá)而非MMP9來抑制細(xì)胞的侵襲能力。miR-25的抑制反而促進了細(xì)胞的侵襲遷

7、移，但MMP2和MMP9均不受其表達(dá)的影響，表明可能存在其他的調(diào)控機制。AKT活性檢測表明，三種miRNA均可以上調(diào)PTEN的表達(dá)而抑制p-AKT的活性。但EGFR表達(dá)結(jié)果卻顯示，只有miR-106b、-93抑制可以引起EGFR的表達(dá)下調(diào)，miR-25則無此作用。這些結(jié)果表明，miR-106b、-93與miR-25尚有不同的生物學(xué)作用機制，對腫瘤的生物學(xué)特性的影響也不盡相同。
　　第三部分研究中我們運用生物信息學(xué)方法分析了miR-

8、106b、-93、-25的預(yù)測靶基因的功能和信號通路聚集點，結(jié)果顯示這三個miRNA的生物學(xué)作用均首先集中在發(fā)育和分化過程，尤以miR-25為甚。除此外，miR-106b較傾向于磷酸化和非磷酸化及細(xì)胞增殖的過程，而miR-93則傾向于代謝的過程，miR-25則是轉(zhuǎn)錄調(diào)控和細(xì)胞間黏附的過程。我們進一步篩選并驗證了RBL2為miR-106b和miR-93的直接作用靶點，并在miR-106b和miR-93參與的細(xì)胞生長調(diào)控過程中發(fā)揮了重要作用

9、。
　　第四部分研究我們驗證了miR-106b～25反義寡核苷酸抑制劑對裸鼠皮下LN229膠質(zhì)瘤細(xì)胞異種移植瘤的體內(nèi)抑瘤效果。結(jié)果顯示單獨和聯(lián)合原位注射miR-106b～25的反義抑制劑均可以明顯抑制膠質(zhì)瘤的生長，抑制miR-25可以促進細(xì)胞的凋亡。
　　通過本研究證明了在膠質(zhì)瘤中miR-106b～25基因簇存在異常高表達(dá)，表達(dá)程度與腫瘤的級別呈正相關(guān)。抑制miR-106b～25可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長。但三種miRNA對膠