重組BMP7腺病毒治療椎間盤退變的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)將原核表達(dá)載體pBlue-BMP7經(jīng)一系列特定的限制性內(nèi)切酶酶切，重組了BMP7的腺病毒載體(Ad-BMP7)，并轉(zhuǎn)染293細(xì)胞進(jìn)行大量擴(kuò)增、滴度測定。重組Ad-BMP7經(jīng)限制性內(nèi)切酶PI-SceI和I-CeuI雙酶切獲得BMP7基因片段，PCR擴(kuò)增得到特異的擴(kuò)增片段，表明重組的Ad-BMP7載體構(gòu)建成功，其中攜帶有目的基因BMP7cDNA片段。 載體構(gòu)建成功后，進(jìn)行人退變髓核細(xì)胞的原代培養(yǎng)，并了解其生物學(xué)特性，用臺盼藍(lán)排

2、斥試驗(yàn)進(jìn)行細(xì)胞活力測定。發(fā)現(xiàn)人退變髓核細(xì)胞貼壁及生長的速度均十分緩慢，首次培養(yǎng)期間，髓核細(xì)胞活力可達(dá)100％，傳1代后細(xì)胞活力為80～90％。將腺病毒介導(dǎo)的綠色熒光蛋白基因(Ad-GFP)轉(zhuǎn)染至髓核細(xì)胞內(nèi)，24小時(shí)后即有綠色熒光發(fā)出，持續(xù)時(shí)間可達(dá)4周。當(dāng)MOI值為150時(shí)，轉(zhuǎn)染陽性率達(dá)100％，說明人退變髓核細(xì)胞可長期表達(dá)外源性基因。 報(bào)告基因轉(zhuǎn)染成功后，將Ad-BMP7轉(zhuǎn)染體外人髓核細(xì)胞，MOl值分別為20、50、100、15

3、0。RT-PCR擴(kuò)增到特異性片斷，WesternBlot檢測細(xì)胞中BMP7在蛋白水平的表達(dá)。免疫組化檢測顯示實(shí)驗(yàn)組呈強(qiáng)陽性染色而對照組呈弱陽性。ELISA檢測上清液中蛋白多糖和II型膠原的含量。發(fā)現(xiàn)二者的含量和病毒MOl值呈劑量依賴性，和對照組、空白組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明人退變髓核細(xì)胞不僅能大量表達(dá)外源性的BMP7基因，還能在基因產(chǎn)物的作用下增加蛋白多糖和II型膠原合成。 體內(nèi)研究中，取20只新西蘭大白兔，15只作為實(shí)驗(yàn)

4、組，5只作為實(shí)驗(yàn)對照組。實(shí)驗(yàn)組椎間盤注射Ad-BMP7(6×106pfu)，實(shí)驗(yàn)對照組注射Ad-GFP(6×10。pfu)，另設(shè)空白對照組。分別于注射后l周、2周和4周各處死5只實(shí)驗(yàn)組兔子，注射后l周處死全部實(shí)驗(yàn)對照組兔子。RT-PCR和免疫組織化學(xué)染色檢測BMP7的表達(dá)情況，免疫組織化學(xué)染色檢測II型膠原的表達(dá)情況。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組的髓核細(xì)胞顯示了BMP7染色陽性結(jié)果，1周、2周和4周組陽性染色率差異無顯著意義。實(shí)驗(yàn)組的髓核組織間質(zhì)II型膠

5、原呈陽性染色，1周、2周和4周的灰度值單因素方差分析：F=10．01，P=0．0028；兩兩比較結(jié)果：第1周與第2、第4周差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，第2、第4周間差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明Ad-BMP7轉(zhuǎn)染兔髓核細(xì)胞后，能獲得長期表達(dá)，并能促進(jìn)II型膠原合成。 本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了重組BMP7腺病毒載體，進(jìn)行了人退變椎間盤細(xì)胞的原代培養(yǎng)并獲得了成功。證明了BMP7基因可以在體內(nèi)體外髓核細(xì)胞中得到持續(xù)的表達(dá)，并能促進(jìn)蛋白多糖和II型膠原的合成。本