生物素化的SA-mGM-CSF融合蛋白海藻酸鈉—殼聚糖微球的制備及性能研究.pdf

1、目的:
　　 通過對各種影響微球質(zhì)量的因素進行考察，制備生物素化的SA-mGM-CSF融合蛋白海藻酸鈉-殼聚糖微球。通過腫瘤細胞錨定實驗和細胞增殖實驗研究包裹在生物素化SA-mGM-CSF融合蛋白海藻酸鈉-殼聚糖微球中的SA-mGM-CSF融合蛋白的生物學(xué)活性，并通過SA的橋連作用，將生物素化的SA-mGM-CSF融合蛋白海藻酸鈉-殼聚糖微球橋連在生物素化的包被多聚賴氨酸的96孔板上（模擬腫瘤細胞表面）。此微球的研制可為進一步研

2、究腫瘤免疫新型靶向治療提供一定的參考。
　　 方法:
　　 1.為了獲得粒徑大小合適，包封率較高的SA-mGM-CSF融合蛋白海藻酸鈉-殼聚糖微球，對影響微球形成的幾個因素:攪拌速度、油水比例、乳化時間、乳化劑加入量、固化時間、藥物加入量、氯化鈣濃度、海藻酸鈉濃度、殼聚糖濃度、交聯(lián)時間進行單一因素的考察試驗。
　　 2.利用殼聚糖既可與生物素結(jié)合，也可與海藻酸鈉交聯(lián)的特性，制備生物素化海藻酸鈉-殼聚糖微球。利用P

3、BS作為體外釋放介質(zhì)，研究生物素化SA-mGM-CSF融合蛋白海藻酸鈉-殼聚糖微球的體外釋藥性能。聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)研究微球包裹前后SA-mGM-CSF融合蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。
　　 3.利用腫瘤細胞表面的氨基易生物素化以及生物素與鏈親和素之間具有高度親和力的特性，對微球包裹前后的SA-mGM-CSF融合蛋白進行流式檢測。并通過小鼠骨髓細胞增殖實驗檢測微球包裹前后SA-mGM-CSF融合蛋白的生物活性是否存在著

4、差異，并驗證不同時間點即前后期釋放的樣品的活性穩(wěn)定性。
　　 4.利用蛋白質(zhì)錨定技術(shù)原理，通過SA的橋連作用，將生物素化的SA-mGM-CSF融合蛋白海藻酸鈉-殼聚糖微球橋連在生物素化的包被多聚賴氨酸的96孔板上（模擬腫瘤細胞表面）。
　　 結(jié)果:
　　 1.通過對影響微球質(zhì)量的因素進行考察分析后，確定了相對較佳的生物素化SA-mGM-CSF融合蛋白海藻酸鈉-殼聚糖微球的制備工藝:攪拌速度為1000rpm/min

5、，油水比例4∶1，乳化60min，加入體積分數(shù)為2％的乳化劑，固化3小時，加入SA-mGM-CSF融合蛋白藥物5mg，氯化鈣的濃度為20g/L，海藻酸鈉的濃度為20g/L，殼聚糖的濃度為20g/L，交聯(lián)時間為60min。在此工藝條件下制備的生物素化SA-mGM-CSF融合蛋白海藻酸鈉-殼聚糖微球約70％的平均粒徑為50um左右，微球表面光滑均勻，包封率為(48.7±1.03)％，載藥量為(4.46±0.41)×10-2％。
　　

6、 2.生物素化SA-mGM-CSF融合蛋白海藻酸鈉-殼聚糖微球的體外釋放實驗顯示，微球可連續(xù)釋放一周以上，在7天內(nèi)的累積釋放百分率為82.22％。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)發(fā)現(xiàn)，微球包裹前后的SA-mGM-CSF融合蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。
　　 3.流式細胞儀檢測微球包裹前后的SA-mGM-CSF融合蛋白對腫瘤細胞的錨定，結(jié)果顯示: SA-mGM-CSF融合蛋白包裹前樣品的錨定修飾效率為98.5％，生物素化SA-mGM

7、-CSF融合蛋白海藻酸鈉-殼聚糖微球中釋放的SA-mGM-CSF融合蛋白對腫瘤細胞表面錨定修飾效率為98.3％。原融合蛋白樣品與微球緩釋的樣品的錨定修飾效率無顯著性差異。小鼠骨髓細胞增殖實驗檢測微球包裹前后SA-mGM-CSF融合蛋白的生物活性無顯著性差異，不同時間點即前后期釋放的樣品的活性穩(wěn)定。
　　 4.實驗結(jié)果顯示，通過與對照組的比較，生物素化的多聚賴氨酸的板+SA+生物素化的SA-mGM-CSF融合蛋白海藻酸鈉-殼聚糖微

8、球的橋連效果最好，表明生物素化的SA-mGM-CSF融合蛋白海藻酸鈉-殼聚糖微球能通過SA的橋連作用結(jié)合在生物素化的包被多聚賴氨酸（模擬腫瘤細胞表面）的96孔板上。
　　 結(jié)論:
　　 本文所制備的其中包裹SA-mGM-CSF融合蛋白的生物素化海藻酸鈉-殼聚糖微球中的蛋白可以緩慢釋放7天以上，腫瘤細胞錨定實驗和細胞增殖實驗表明生物素化SA-mGM-CSF融合蛋白海藻酸鈉-殼聚糖微球中的SA-mGM-CSF融合蛋白具有生物