膜表達型InsB15-23和IGRP206-214H-2Kd單鏈三聚體真核表達載體對NOD小鼠Ⅰ型糖尿病的影響.pdf

1、Ⅰ型糖尿病(TID)是一種器官特異性自身免疫性疾病。在疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中會出現(xiàn)多種自身抗原，包括胰島素(Ins)、谷氨酸脫羧酶(GAD)、葡萄糖-6-磷酸催化亞基相關(guān)蛋白(IGRP)等，其中有些抗原表位在疾病的進程中扮演著重要的角色，如InsB15-23、GAD65P90、IGRP206-214，而且它們之間還存在抗原表位擴展的現(xiàn)象。在Ⅰ型糖尿病進程中，InsB15-23特異性CTL被認為是起始的抗原表位特異性CTL，對于其他抗原表

2、位的暴露及相應CTL的誘導起到了關(guān)鍵性作用;葡萄糖-6-磷酸催化亞基相關(guān)蛋白(IGRP)是多種膜系統(tǒng)的組成成分，有報道發(fā)現(xiàn)采用毒素偶聯(lián)的四聚體選擇性清除IGRP206-214特異性CTL，能夠顯著性延遲NOD小鼠Ⅰ型糖尿病的發(fā)生。因此本研究選取InsB15-23、IGRP206-214做為研究對象，分別觀察mInsB15-23H-2KdSCT、mIGRP206-214H-2KdS CT兩種膜表達型單鏈三聚體對NOD小鼠Ⅰ型糖尿病進程的影

3、響。
　　我們首先以本實驗室前期構(gòu)建的mInsB15-23H-2KdSCT真核表達載體為基礎(chǔ)，進一步構(gòu)建mIGRP206-214H-2KdSCT真核表達載體，然后用mInsB15-23H-2KdSCT真核表達載體轉(zhuǎn)染K562細胞，用H-2Kd的抗體作為一抗，通過免疫熒光法確定mInsB15-23H-2KdSCT能夠在真核細胞內(nèi)表達并定位在細胞膜上。
　　采用mInsB15-23H-2KdSCT和mIGRP206-214H-2

4、KdSCT兩種真核表達載體分別給3周齡、7周齡的NOD母鼠皮下注射，以皮下注射pCDNA3.1(-)真核表達載體組小鼠作為實驗對照，發(fā)現(xiàn)mInsB15-23-H-2KdSCT組與對照組相比，NOD小鼠的動態(tài)血糖、30周齡時平均血糖和發(fā)病率均比對照組低，表明mInsB15-23-H-2KdSCT具有顯著延遲NOD小鼠血糖升高的趨勢，而mIGRP206-214-H-2Kd-SCT組與對照組相比，NOD小鼠的動態(tài)血糖、30周齡時平均血糖和發(fā)病

5、率均比對照組高，表明mIGRP206-214H-2KdSCT沒有延遲NOD小鼠血糖升高的趨勢。
　　為了探索mInsB15-23H-2KdSCT和mIGRP206-214H-2KdSCT延遲NOD小鼠血糖升高的機制，我們試圖制備相關(guān)H-2Kd四聚體，用于檢測NOD小鼠體內(nèi)特異性CTL的變化。我們以本實驗室前期制備的pET22b-InsB15-23-β-2m-H-2-Kd為基礎(chǔ)，通過基因工程的方法成功地構(gòu)建了pET22b-IGRP2

6、06-214-β2m-H-2-Kd原核表達載體。通過包涵體的洗滌、蛋白純化、復性、超濾、截留、交換buffer、生物素化、去游離生物素、然后將將純化蛋白與一定量PE標記的鏈酶親和素共孵育，成功制備PE標記的IGRP206-214四聚體（IGRP206-214-Tetramer-PE）。選用NOD小鼠作為實驗對象，以BALB/c小鼠作為陰性對照，發(fā)現(xiàn)NOD小鼠IGRP206-214-Tetramer+、CD8+雙陽性細胞高于對照組，且存在

7、統(tǒng)計學的差異，證明我們制備的此四聚體能夠用于IGRP206-214特異性CTL的檢測。
　　我們使用mInsB15-23H-2KdSCT真核表達載體在NOD小鼠3周齡時進行皮下接種、mIGRP206-214H-2KdSCT真核表達載體在NOD小鼠7周齡時進行皮下接種，利用自制的IGRP206-214-Tetramer分析其對外周血IGRP206-214特異性CTL的影響。結(jié)果顯示過表達mInsB15-23H-2KdSCT的NOD小

8、鼠在16、40周齡時外周血IGRP206-214特異性CTL比例有降低的趨勢，但與對照組相比無統(tǒng)計學差異;由于時間的限制，我們沒有在最佳的時間點(8周、10周、12周)進行監(jiān)測，因此過表達mInsBI5-23H-2KdSCT能否降低IGRP206-214特異性CTL頻率尚無法判斷;而接種了mIGRP206-214H-2KdSCT真核表達載體的NOD小鼠外周血IGRP206-214特異性CTL頻率與對照組相比經(jīng)歷了增高、又趨于相同的變化過

9、程，表明mIGRP206-214H-2KdSCT可能具有誘導IGRP206-214特異性CTL增殖的功能。
　　全文表明針對疾病早期暴露的抗原(Ins)，過表達mInsB15-23H-2Kd-SCT可以顯著降低NOD小鼠T1D的發(fā)病率;但是尚無法判斷其能否降低NOD小鼠IGRP206-214特異性CTL數(shù)量;針對疾病中后期暴露的抗原(IGRP)，盡管過表達mIGRP206-214H-2Kd-SCT能增加NOD小鼠IGRP206-2