獸醫(yī)中藥免疫增強劑的篩選試驗及其藥理學研究.pdf

1、本研究旨在通過一系列體內(nèi)外試驗研制開發(fā)一種療效確實的中藥免疫增強劑。試驗內(nèi)容共分四個部分，第一部分通過體內(nèi)試驗制造免疫抑制模型篩選有效的中藥免疫增強方劑，第二部分則對篩選出的中藥免疫增強劑的急性毒性和細胞毒性進行檢測，第三部分在藥物的安全濃度范圍內(nèi)進行了大量的體外免疫學研究，第四部分又重新回到整體動物試驗，重點從免疫學的角度驗證了該中藥免疫增強劑的免疫增強功能及機理。 第一部分中藥免疫增強劑篩選試驗分別給正常小鼠和環(huán)磷酰胺(Cy

2、)所致免疫抑制小鼠飲服中藥：1個經(jīng)典方劑(YPF，玉屏風散)和3個自擬方劑(TJJ1、TJJ2、TJJ3)，以環(huán)磷酰胺(Cy)制造免疫抑制病理模型，以玉屏風散為對照，檢測所擬中藥方劑對小鼠血液學指標、體重、臟器指數(shù)的影響和脾、肝組織病理學變化，從中篩選最佳方劑。結(jié)果：(1)上述中藥方劑對健康小鼠血液學指標(WBC、RBC、HGB、HCT、MCH、MCV)的影響不顯著(P>0.05)，而對Cy所致的免疫抑制小鼠作用明顯(P<0.05)，特

3、別是方劑TJJ2總體效果好；(2)各中藥方劑對正常小鼠體重及臟器指數(shù)的影響均不明顯(P>0.05)，而對Cy所致的免疫抑制小鼠作用顯著(P<0.05)，以TJJ2和YPF為好；(3)病理組織切片顯示，TJJ2模型組和YPF模型組小鼠脾白髓大而明顯，肝細胞輕度變性壞死；而Cy對照組脾白髓不明顯，肝細胞嚴重變性壞死。根據(jù)上述各項指標檢測結(jié)果綜合認為，在3個自擬方劑中，TJJ2作用最好，可選定為后續(xù)試驗的研究對象(簡寫為TJJ)。 第

4、二部分中藥免疫增強劑(TJJ)急性毒性及細胞毒性測定通過體內(nèi)外不同試驗途徑和方法測定中藥免疫增強劑(TJJ)對小鼠的急性毒性和細胞毒性，以確保臨床用藥安全。體內(nèi)急性毒性試驗以半數(shù)致死量(LD<,50>)和最大耐受量(MTD)為指標，用40g/kg體重劑量的TJJ灌胃小鼠，1wk后小鼠未發(fā)生死亡，再在小鼠可接受的最大容積下，給小鼠灌服日累積劑量為120g/kg體重的TJJ進行MTD試驗，1wk后處死觀察其病理變化。體外試驗采用形態(tài)學觀察和

5、MTT兩種方法，測試TJJ在CEF、L929體外培養(yǎng)中的最大安全濃度(TC<,0>)。結(jié)果表明： (1)TJJ急性毒性很低，其LD<,50>超過40g/kg體重，MTD超過120g/kg體重。根據(jù)毒性分級標準，可認為該免疫增強劑在短期內(nèi)使用是安全的。 (2)體外培養(yǎng)結(jié)果，TJJ對CEF和L929細胞的最大無毒濃度分別達3.12g/L和1.56g/L，為后續(xù)的體外免疫藥理學研究提供依據(jù)。 第三部分體外研究中藥免疫增強劑對小鼠細胞免

6、疫及抗病毒、抗腫瘤活性的影響首先用環(huán)磷酰胺(Cy)制造免疫抑制小鼠細胞模型，模型細胞培養(yǎng)和正常細胞培養(yǎng)同時進行，采用MTT、法檢測小鼠脾淋巴細胞增殖反應(yīng)和NK細胞殺傷活性，并對影響MTT法的關(guān)鍵因素細胞密度、影響NK細胞殺傷活性的不同效靶比例和不同作用時間等條件進行了篩選優(yōu)化，采用中性紅染料吸收法檢測小鼠腹腔Mψ吞噬功能，以探討在體外培養(yǎng)條件下，不同濃度的TJJ和YPF對小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化、NK細胞殺傷活性及腹腔Mψ吞噬功能的影響。結(jié)果

7、表明：(1)脾淋巴細胞密度在1～6×10<'9>個/L時呈指數(shù)生長，脾臟NK細胞在效靶比為50：1、作用時間在18h時能穩(wěn)定和較高的反映NK細胞的殺傷活性。(2)對正常小鼠，不同濃度的TJJ和YPF對脾淋巴細胞增殖反應(yīng)、NK細胞的殺傷活性影響不顯著(P>0.05)，但能增強腹腔Mψ吞噬活性；對Cy所致免疫抑制小鼠，100～1200μg/ml的TJJ和YPF、對脾淋巴細胞增殖反應(yīng)、NK細胞的殺傷活性有不同程度的影響(P>0.05)，其中T

8、JJ在400μg/ml時作用顯著(P<0.05)。 用Reed-Muench氏法進行病毒感染滴度測定，然后采用L929-VSV檢測系統(tǒng)進行不同濃度的TJJ及YPF對VSV增殖的抑制作用研究，用微量細胞病變抑制法檢測中藥誘導小鼠脾淋巴細胞產(chǎn)生IFN-γ的活性，探討在體外培養(yǎng)條件下，不同濃度的TJJ和YPF是否能對VSV的增殖產(chǎn)生抑制作用，以及是否能誘導小鼠脾淋巴細胞產(chǎn)生IFN-γ并對其活性進行檢測。結(jié)果表明，(1)TJJ和YPF均

9、不具備體外抗VSV活性。(2)TJJ和YPF誘導的脾淋巴細胞上清有一定的抗VSV活性，TJJ表現(xiàn)為400μg/ml時作用稍好，YPF表現(xiàn)為500μg/ml時作用稍好，但各濃度中藥誘導的脾淋巴細胞上清均不能完全抑制VSV對L929細胞的破壞作用(P>0.05)。說明在體外培養(yǎng)條件下，TJJ和YPF都不具備體外抗VSV活性，其誘導的脾淋巴細胞上清有一定的抗VSV作用。 采用不同濃度的TJJ與NS-1共培養(yǎng)，作用一定時間(12h、18

10、h、24h、36h、48h)后加入．MTT，酶標儀讀取光密度值，以研究體外培養(yǎng)條件下不同濃度的TJJ的抗腫瘤細胞增殖活性。結(jié)果表明，各培養(yǎng)時間均未見TJJ有抗腫瘤細胞增值作用；隨著培養(yǎng)時間的延長(超過24h)TJJ有一定的促進腫瘤細胞生長的作用。 第四部分體內(nèi)研究中藥免疫增強劑對小鼠免疫功能及抗氧化功能的影響以Cy誘導建立小鼠免疫抑制模型，采用分光光度法檢測小鼠血清半數(shù)溶血值(HC<,50>)，用MTT法檢測淋巴細胞增殖反應(yīng)，流

11、式細胞術(shù)檢測T淋巴細胞亞群的變化，以探討TJJ對正常小鼠及Cy所致免疫抑制小鼠細胞免疫功能的影響；采用胸腺細胞增殖法檢測IL-2的活性，用微量細胞病變抑制法檢測IFN-γ活性，探討中藥方劑對Cy所致免疫抑制小鼠脾淋巴細胞產(chǎn)生細胞因子的影響；并同時檢測血清中的NO、MDA和SOD的含量，以觀察TJJ及YPF對正常小鼠及Cy所致免疫抑制小鼠抗氧化能力的影響。結(jié)果表明：(1)Cy在SRBC免疫后引起溶血素(HC<,50>)生成反應(yīng)顯著降低(P

12、<0.05)，而用藥組(TJJ組和YPF組)的HC<,50>明顯高于Cy組，差異顯著(P<0.05)，且以TJJ作用為好，與YPF比差異顯著(P<0.05)。(2)各試驗組脾細胞在48h內(nèi)的淋巴細胞轉(zhuǎn)化率與脾細胞中加入含藥血清在相同培養(yǎng)時間內(nèi)的淋巴細胞轉(zhuǎn)化率所表現(xiàn)的結(jié)果有完全一致的趨勢，即TJJ和YPF對免疫功能異常的小鼠脾淋巴細胞具有明顯的促轉(zhuǎn)化功能，TJJ組和YPF組淋轉(zhuǎn)值明顯高于正常對照組和Cy組(P<0.05)，且TJJ組優(yōu)于Y

13、PF組(P<0.05)；另外，TJJ和YPF可以明顯提高免疫抑制小鼠CD3、CD8水平，降低由于Cy引起的CD4/CD8升高的比值，與模型組比較差異顯著(P<0.05)。(3)胸腺中淋巴細胞增殖反應(yīng)的最適細胞密度為3～8×10<'9>個/L；試驗各組小鼠脾淋巴細胞誘導上清在1:4～1：32的稀釋度下表現(xiàn)為較強的IL-2活性，中藥組與模型對照組差異顯著(P<0.05)，Cy+TJJ組誘生的IFN-γ活性最高(8.1414±0.5589)l