銅綠假單胞菌噬菌體PaP3生物學(xué)特性的研究與噬菌體基因組改造的技術(shù)準(zhǔn)備.pdf

1、噬菌體是細(xì)菌的病毒，廣泛的存在于自然環(huán)境之中。作為細(xì)菌之間基因水平轉(zhuǎn)移的重要載體，噬菌體與轉(zhuǎn)座子、整合型質(zhì)粒、致病島、插入序列等可移動(dòng)DNA元件一起，在細(xì)菌基因組的進(jìn)化、細(xì)菌的致病性、耐藥性以及細(xì)菌對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性中都具有非常關(guān)鍵的作用。溶原性噬菌體通過自身攜帶的外源性遺傳物質(zhì)改變著宿主菌及自身的基因組構(gòu)成，進(jìn)而改變了宿主菌的生物學(xué)性狀，對(duì)噬菌體展開廣泛深入的研究對(duì)于了解噬菌體與宿主的相互作用、揭示生物的多樣性等方面具有重要的意義。因此，

2、噬菌體及其基因組功能的研究成為微生物學(xué)研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域之一。近年來(lái)由于抗生素的廣泛使用，細(xì)菌的多重耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重，尋求新的抗菌手段已成為當(dāng)務(wù)之急。噬菌體作為特異性感染并裂解細(xì)菌的病毒，可望成為一種新的抗細(xì)菌感染制劑。但是，噬菌體感染細(xì)菌的特異性決定了它的抗菌譜很窄，為了解決這一問題，必須對(duì)噬菌體進(jìn)行人工改造以擴(kuò)大它的宿主譜。在分子生物學(xué)技術(shù)高度發(fā)展的今天，人工改造噬菌體已經(jīng)成為可能。但在進(jìn)行噬菌體改造之前，必須進(jìn)行一些必要的技術(shù)準(zhǔn)備，如

3、：通過什么手段來(lái)改造噬菌體，改造后的噬菌體基因組如何導(dǎo)入宿主菌從而產(chǎn)生感染性的噬菌體顆粒等等。這些都是有待于克服的技術(shù)屏障。 本文以本室分離鑒定的一株銅綠假單胞菌噬菌體PaP3為研究對(duì)象，首先探討其生物學(xué)特性；進(jìn)而建立一種利用分子生物學(xué)技術(shù)改造噬菌體基因組的方法；最后探討將改造后的噬菌體基因組電轉(zhuǎn)導(dǎo)入宿主菌的方法。研究?jī)?nèi)容及其結(jié)果主要包括以下幾個(gè)方面： 1.銅綠假單胞菌噬菌體PaP3生物學(xué)特性的研究。 ①電鏡觀察

4、發(fā)現(xiàn)，PaP3有一個(gè)多面體立體對(duì)稱頭部，頭部直徑約為65nm，無(wú)囊膜，有一個(gè)短尾。從病毒顆粒的形態(tài)來(lái)看，噬菌體PaP3屬于短尾噬菌體科。 ②PaP3感染其宿主菌銅綠假單胞菌PA3形成的噬斑明顯，為圓形半透明，直徑在2mm左右，呈典型的溫和噬菌體的噬斑特征。 ③測(cè)定噬菌體PaP3的一步生長(zhǎng)曲線，得知PaP3感染宿主菌的潛伏期約為20min，爆發(fā)期約為60min，爆發(fā)量約為31。該曲線反映出噬菌體從感染宿主菌到子代釋放的一個(gè)

5、完整的生活周期。 ④當(dāng)MOI=0.001時(shí)，噬菌體PaP3感染其宿主菌產(chǎn)生的子代噬菌體滴度為4.0×1010pfu/ml，產(chǎn)出率最高。確定了噬菌體PaP3感染其宿主菌銅綠假單胞菌的最佳感染復(fù)數(shù)為0.001。 ⑤測(cè)定了本室保存的三株銅綠假單胞菌噬菌體與抗血清之間的交叉吸附常數(shù)。結(jié)果表明，三株噬菌體的抗血清只抑制自身與對(duì)應(yīng)宿主菌的結(jié)合，不存在交叉抑制吸附關(guān)系。說(shuō)明三株噬菌體的吸附結(jié)構(gòu)之間不存在相關(guān)性。 2.噬菌體Pa

6、P3基因組的改造 基因組的改造包括基因的插入、刪除、定點(diǎn)突變等方式。本研究采用刪除目的基因的方法對(duì)PaP3基因組進(jìn)行改造，即選擇限制性內(nèi)切酶PacⅠ、SphⅠ和SacⅡ?qū)aP3基因組進(jìn)行分步酶切，獲得目的基因所在的片段，再利用PCR刪除技術(shù)去除該目的基因(在本研究中為tRNA基因)。最后將刪除改造后的片段與其他酶切片段按順序連接起來(lái)，即獲得人工改造后的PaP3基因組。 3.改造后PaP3基因組電轉(zhuǎn)化宿主菌。 ①

7、PaP3基因組電轉(zhuǎn)化宿主菌的條件摸索。純化噬菌體PaP3完整基因組DNA，以銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)PA3為受體菌，探討電轉(zhuǎn)化基本條件，包括：細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)、感受態(tài)細(xì)胞的制備方式、電場(chǎng)強(qiáng)度、DNA濃度、細(xì)胞密度等條件對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響。確定了一組適用于電轉(zhuǎn)化噬菌體PaP3基因組DNA的條件：在含50μg/ml紅霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主菌14h-16h，以100mM蔗糖溶液為介質(zhì)，在25℃條件下制備感受態(tài)細(xì)

8、胞，適宜的感受態(tài)細(xì)胞濃度為1011/ml，適宜的電轉(zhuǎn)參數(shù)為12kV/cm，300Ω，25μF。在此條件下獲得較高的轉(zhuǎn)化效率，可達(dá)2.1×103pfu/μgDNA。這為改造后噬菌體基因組的電轉(zhuǎn)奠定了基礎(chǔ)。 ②改造后基因組的電轉(zhuǎn)。將刪除了tRNA基因的PaP3基因組按前面摸索的銅綠假單胞菌噬菌體基因組電轉(zhuǎn)化宿主菌的條件進(jìn)行電轉(zhuǎn)，未能獲得具有感染性的噬菌體顆粒。在本文中對(duì)其原因進(jìn)行了探討。 綜上所述，通過本研究，初步明確了銅綠