腫瘤微環(huán)境中骨髓間充質干細胞惡性轉化的研究.pdf

1、目的：
　　 明確作為腫瘤治療載體的骨髓間充質干細胞（mesenchymal stemcells，MSCs）在腫瘤微環(huán)境中是否受到其中的細胞因子、信號分子及細胞間相互作用的影響而自身發(fā)生腫瘤轉化，轉化的細胞在裸鼠體內是否能夠形成腫瘤，進而為MSCs進行修飾以規(guī)避其瘤化的危險性，使其更加安全地應用于臨床提供前期實驗基礎。
　　 材料與方法：
　　 1.細胞培養(yǎng)：取Wistar大鼠的股骨和脛骨骨髓，貼壁篩選法體外分離

2、、培養(yǎng)、擴增MSCs；C6膠質瘤細胞采用與MSCs相同的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。
　　 2.實驗分組：本實驗分體外實驗和體內實驗，體外實驗設為兩組即對照組（單獨培養(yǎng)的MSCs），實驗組（間接共培養(yǎng)組：transwell插入式培養(yǎng)皿結合6孔板構建MSCs和C6細胞共培養(yǎng)體系；直接共培養(yǎng)組：GFP腺病毒標記MSCs后加入C6細胞共同培養(yǎng)）；體內實驗分三組：陰性對照組（體外單獨培養(yǎng)的MSCs注入裸鼠體內），陽性對照組（C6膠質瘤細胞注入裸鼠體

3、內），實驗組（與C6膠質瘤細胞非接觸共培養(yǎng)后的MSCs注入裸鼠體內）。
　　 3.實驗方法：
　　 1）共培養(yǎng)過程中倒置相差顯微鏡下連續(xù)觀察細胞形態(tài)的變化。
　　 2）根據細胞周期的改變及核干細胞因子（necleostemin，NS）的表達變化檢測細胞增值力的改變。
　　 3）采用實時熒光定量PCR檢測實驗組和對照組細胞中抑癌基因p53mRNA和癌基Dqmdm2 mRNA的變化。
　　 4）免疫熒

4、光法和westernblot分析突變型p53蛋白和mdm2蛋白的表達變化。
　　 5）常規(guī)染色體及G顯帶核型分析方法檢測培養(yǎng)后兩組細胞的染色體的改變。
　　 6）免疫熒光法檢測神經膠質細胞及其腫瘤特異的膠質纖維酸蛋白（Glial fibrillary acidic protein，GFAP）在細胞中的定位及表達。
　　 7）與C6膠質瘤細胞體外共培養(yǎng)發(fā)生轉化的MSCs植入裸鼠皮下，連續(xù)觀察其裸鼠形體的變化，4周、

5、8周后取材，組織病理檢測細胞的存活轉化及腫瘤形成，免疫組化檢測形成的組織中GFAP蛋白的表達情況。
　　 結果：
　　 1）利用貼壁篩選法獲得的MSCs的純度較高，第4代的MSCs形態(tài)均一，細胞扁平，成纖維細胞樣，分布均勻，排列有序。與C6膠質瘤細胞共培養(yǎng)7d后，實驗組細胞形態(tài)發(fā)生顯著變化，胞質向胞核周圍收縮，細胞變細變長，胞核變小，類似于神經膠質瘤細胞樣的形狀。
　　 2）流式細胞周期檢測示實驗組G1期細胞比例

6、降低，S期比例升高，兩組比較無統計意義（p>0.05）；NS蛋白的表達兩組間無顯著差異。
　　 3）定量PCR結果示實驗組p53 mRNA表達降低，是對照組的0.24倍（p<0.01），而mdm2 mRNA表達升高，是對照組的3.18倍（p<0.01）；免疫熒光及westernblot結果示實驗組部分細胞中表達突變型p53蛋白，而對照組無該蛋白表達，實驗組mdm2癌蛋白高度擴增，與對照組比較p<0.05。
　　 4）染色

7、體核型分析結果為對照組細胞染色體眾數是42，實驗組細胞染色體變動于38到42條之間，其中41條染色體所占比例為33％，說明共培養(yǎng)后實驗組細胞染色體數目出現非整倍體的改變，G顯帶未見明顯的核型改變。
　　 5）免疫熒光結果示實驗組幾乎所有細胞表達GFAP蛋白，而對照組僅為13％，兩組比較p<0.05。
　　 6）以注射的方式將體外培養(yǎng)已轉化的MSCs植入裸鼠皮下，4-8周后大體標本可見實驗組植入區(qū)新生物形成，取新生組織HE