豬流感病毒H3N2亞型HA基因的表達(dá)以及免疫效力的研究.pdf

1、豬流感病毒血清學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，我國(guó)豬群廣泛存在H3N2亞型流感病毒，為了有效的控制豬流感的發(fā)生，研制有效的疫苗進(jìn)行預(yù)防是控制流感發(fā)生和切斷禽-豬-人傳播途徑的有效方法，目前用于豬流感的疫苗主要為滅活疫苗，相對(duì)于禽流感疫苗由傳統(tǒng)的全病毒滅活疫苗、亞單位疫苗、重組活載體疫苗、基因疫苗的發(fā)展而言，豬流感的疫苗研發(fā)相對(duì)落后。 本試驗(yàn)選取豬流感病毒株的HA基因做為研究對(duì)象，主要做了以下研究： 1、豬流感病毒A/Swine/Sich

2、uan/01/2006(H3N2)HA基因的原核表達(dá)載體的構(gòu)建 本試驗(yàn)根據(jù)HA蛋白全基因序列和原核表達(dá)載體pET32a(+)，設(shè)計(jì)了一對(duì)包含HA基因開(kāi)放閱讀框(去除信號(hào)肽)約1680bp，同時(shí)引入SacI和NotI酶切位點(diǎn)的一對(duì)引物；將PCR產(chǎn)物回收后連接pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)鑒定篩選陽(yáng)性克隆菌抽質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，同時(shí)對(duì)pET32a(+)進(jìn)行雙酶切，將二者回收后連接并轉(zhuǎn)化DH5α。篩選陽(yáng)性菌落進(jìn)行IPTG誘

3、導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)聚丙酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測(cè)，未見(jiàn)目的性蛋白條帶，推測(cè)可能是由于表達(dá)片段較長(zhǎng)，導(dǎo)致宿主菌代謝負(fù)擔(dān)過(guò)載或HA基因中有影響HA表達(dá)的序列或元件。 2、豬流感病毒A/Swine/Sichuan/01/2006(H3N2)HA基因的真核表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá) HA基因是豬流感病毒重要的保護(hù)性抗原基因。為了研究HA基因疫苗，用PCR擴(kuò)增豬流感病毒HA基因，全長(zhǎng)1701bp，經(jīng)KpnI和NotI雙酶切將其

4、克隆到pcDNA3.1(+)上得到真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-HA。重組質(zhì)粒pcDNA-HA經(jīng)在脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，通過(guò)間接免疫熒光分析，證明HA基因在Vero細(xì)胞中成功地進(jìn)行了瞬時(shí)表達(dá)。 3、HADNA疫苗的小鼠免疫和攻毒保護(hù)試驗(yàn) 用聚乙二醇方法大量提取、純化重組質(zhì)粒pcDNA-HA；用0.1％的福爾馬林溶液滅活豬流感病毒A/Swine/Sichuan/01/2006(H3N2)。6-8周齡小鼠分為四組，第

5、一組滅活全病毒100ul，免疫2次；第二組用表達(dá)HA的DNA疫苗pcDNA-HA100ug免疫二次；第三組用表達(dá)HA的DNA疫苗pcDNA-HA100ug初次免疫，滅活全病毒100ul加強(qiáng)免疫。第四組對(duì)照組沒(méi)有免疫作為陰性對(duì)照。每組10只，免疫二次，間隔三周。加強(qiáng)免疫二周后小鼠斷尾采血，分離血清，用血凝抑制試驗(yàn)(HI)測(cè)定血清中抗體水平；加強(qiáng)免疫三周后用7％戊巴比妥鈉麻醉小鼠，然后用104EID50的豬流感H3N2型病毒滴鼻攻擊，觀察小

6、鼠發(fā)病狀況。攻毒后第3d、第9d每組隨機(jī)抽取3只，取小鼠肺沈液測(cè)定肺部病毒殘存；攻毒后第9d，小鼠斷尾采血，分離血清，用血凝抑制試驗(yàn)(HI)測(cè)定血清抗體水平。結(jié)果表明加強(qiáng)免疫后，各免疫組都能產(chǎn)生抗體，第二組與其他兩組相比，抗體水平偏低，第一組和第三組差異不顯著；攻毒后第9d，檢測(cè)到第一組、第二、三組抗體水平都有升高，各免疫組之間差異不顯著，各免疫組與對(duì)照組之間差異極顯著(P＜0.01)，第二組在攻毒后抗體水平增長(zhǎng)幅度較大，表明HADNA