CYP2E1對擴張型心肌病及肥厚型心肌病的調節(jié)機制研究.pdf

1、目的：細胞色素氧化酶P4502E1(cytochrome P4502E1,CYP2E1)參與生物體內許多內源性和外源性物的代謝,如乙醇、四氯化碳、丙酮和花生四烯酸等。CYP2E1主要主要分布在肝臟,在腦、肺、胃、腸、心臟等也有高表達。CYP2E1參與脂質過氧化、細胞凋亡等過程,與脂肪性肝病、糖尿病及腫瘤等疾病相關。目前,關于CYP2E1在心臟中的作用以及與心肌病的關系研究未見報道。因此本實驗構建了心臟特異的CYP2E1轉基因小鼠,用于分

2、析CYP2E1基因在心臟發(fā)育過程中的作用以及對cTnTR141W轉基因擴張型心肌病(DCM)及cTnTR92Q轉基因肥厚型心肌病(HCM)小鼠的調節(jié)作用。
　　 方法： cTnTR141W及cTnTR92Q轉基因小鼠基因表達芯片及逆轉錄PCR和western blot檢測CYP2E1于擴張型心肌病及肥厚型心肌病模型小鼠中的表達變化。Western blot檢測CYP2E1于野生型C57BL/6J小鼠中的時程表達變化。PCR擴增小

3、鼠CYP2E1的cDNA序列,并將其插入α-MHC啟動子下游,構建心臟特異轉基因表達載體,通過顯微注射法建立CYP2E1轉基因C57BL/6J小鼠,并分別與cTnTR141W及cTnTR92Q轉基因小鼠雜交獲得雙轉基因小鼠。M型超聲心動圖檢測CYP2E1、cTnTR141W、CYP2E1×cTnTR141W、cTnTR92Q及CYP2E1×cTnTR92Q轉基因小鼠心臟的結構形態(tài)和功能變化,并記錄其生存狀況。病理組織學染色觀察CYP2E

4、1、cTnTR141W、CYP2E1×cTnTR141W、cTnTR92Q及CYP2E1×cTnTR92Q轉基因小鼠心臟組織學改變。分光光度法檢測CYP2E1、cTnTR141W、CYP2E1×cTnTR141W、cTnTR92Q及CYP2E1×cTnTR92Q轉基因小鼠心臟H2O2、丙二醛(MDA)、還原性谷胱甘肽(GSH)及總抗氧化能力(T-AOC)變化。透射電鏡觀察CYP2E1轉基因小鼠心臟超微結構改變。逆轉錄PCR及和weste

5、rn blot檢測CYP2E1轉基因小鼠心肌肥厚分子marker表達變化。Western blot檢測CYP2E1轉基因小鼠心臟信號分子的變化。
　　 結果： cTnTR141W及cTnTR92Q轉基因小鼠基因表達芯片及逆轉錄PCR和western blot結果顯示,CYP2E1于肥厚型心肌病模型小鼠心肌中的表達上調,于擴張型心肌病模型小鼠心肌中的表達下調。CYP2E1在野生型C57BL/6J小鼠胚胎期心臟中未見表達,出生后一至

6、二周表達最高,之后隨著年齡增長表達下調。建立了心臟組織特異的CYP2E1高表達轉基因小鼠,同時建立了心臟組織特異的CYP2E1×cTnTR141W及CYP2E1×cTnTR92Q兩種雜交小鼠。M型超聲心動圖結果表明CYP2E1的過表達:使野生型小鼠發(fā)生DCM表型,即心腔擴大,心壁變薄,心功能下降；使cTnTR141W轉基因小鼠心臟的DCM表型更加嚴重:使cTnTR92Q轉基因小鼠心臟向心衰發(fā)展,即心臟出現(xiàn)失代償性的心室腔變大,室壁變薄,

7、心功能下降。心臟組織學顯示,CYP2E1的過表達加重野生型小鼠、cTnTR141W和cTnTR92Q轉基因小鼠的心肌排列紊亂、肥大及間質纖維化程度。至5月齡,CYP2E1轉基因小鼠死亡率為8％；cTnTR141W轉基因小鼠死亡率為16％；CYP2E1×cTnTR141W轉基因小鼠死亡率為48％；cTnTR92Q轉基因小鼠死亡率為4％；CYP2E1×cTnTR92Q轉基因小鼠死亡率為20％。電鏡檢測顯示CYP2E1轉基因小鼠心臟肌纖維粗細

8、不均一,肌漿網擴張,溶酶體增多,線粒體腫脹并伴有脊斷裂。RT-PCR及western blot結果表明CYP2E1轉基因小鼠心臟心肌細胞肥大分子標志物,包括肌小節(jié)蛋白基因Myot、Cnn1,細胞骨架蛋白基因Acta1,細胞外基質基因Colla1、Col3a1,信號傳導相關基因Nppa及Nppb均表達增加。分光光度法檢查結果表明CYP2E1的過表達可增加野生型小鼠、cTnTR141W和cTnTR92Q轉基因小鼠心臟中H2O2和MDA含量,