西瑪津?qū)蓷惏l(fā)育影響的分子生物學(xué)研究.pdf

1、西瑪津（Simazine，2-Chloro-4，6-bis Ethylamino-1，3，5-Triazine）是一種在農(nóng)業(yè)，園藝和休閑場(chǎng)所廣泛應(yīng)用的三嗪除草劑。該除草劑從1955被研發(fā)上市。西瑪津能夠通過化學(xué)、光催化或者生物過程進(jìn)行降解。降解研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)西瑪津在土壤和水中的半衰期在幾天和150天間變化。溫度和濕度能夠影響西瑪津的半衰期，低溫和干燥能夠延長(zhǎng)降解時(shí)間。2009年，美國(guó)環(huán)?？偩骤b于西瑪津的多重暴露途徑和高生產(chǎn)量，將其列入內(nèi)分

2、泌干擾物篩選計(jì)劃(EDSP)。在中國(guó)，西瑪津也是一種在地下水和地表水中經(jīng)常被檢測(cè)到的除草劑。
　　內(nèi)分泌干擾物是指由能夠干擾天然荷爾蒙的合成、分泌、運(yùn)輸、結(jié)合、活性的外源物質(zhì)，從而導(dǎo)致有關(guān)體內(nèi)平衡、生殖、發(fā)育和行為的異常。研究顯示，西瑪津?qū)儆趦?nèi)分泌干擾物(EDCs)，在體外的抗雄激素篩選實(shí)驗(yàn)中西瑪津表現(xiàn)出了刺激效應(yīng);在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，西瑪津?qū)Χ鄠€(gè)物種的生長(zhǎng)、發(fā)育、免疫和內(nèi)分泌系統(tǒng)都產(chǎn)生了不利影響，包括對(duì)哺乳類和兩棲類的生殖系統(tǒng)毒性。<

3、br>　　西瑪津由于其在土壤和水中的高殘留，在美國(guó)、歐洲和澳大利亞的地表水和地下水中是經(jīng)常被檢測(cè)到的第二類物質(zhì)，在我國(guó)河流和出廠水中也時(shí)常被檢測(cè)到。西瑪津在地表水和地下水中的濃度因?yàn)闀?huì)受到季節(jié)和被調(diào)查地區(qū)使用以西瑪津?yàn)榛境煞值某輨┑姆秶挠绊?，所以是可變的。在美?guó)西瑪津在地表水中的濃度可以高達(dá)1300μg/L，在地下水中高達(dá)800μg/L。根據(jù)WHO的水純凈標(biāo)準(zhǔn)，自來水中西瑪津的濃度達(dá)到2μg/L時(shí)便被認(rèn)為是污染水。所以，本研究將西

4、瑪津的濃度設(shè)為0.1、1、10和100μg/L，該濃度梯度包括了從低到高多個(gè)西瑪津的環(huán)境相關(guān)濃度，確保高濃度的西瑪津能夠?qū)?shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生發(fā)育毒性，以便進(jìn)一步的對(duì)其毒性作用機(jī)制進(jìn)行研究。
　　兩棲類具有復(fù)雜的生活周期和滲透性的皮膚，能通過多路徑暴露于陸地和水體中的環(huán)境污染物，這些特性使他們成為一種檢測(cè)內(nèi)分泌干擾物暴露和相關(guān)作用的理想的模式生物。同時(shí)，環(huán)境污染是導(dǎo)致近年來全球兩棲類數(shù)量大量減少的主要原因。兩棲類成為當(dāng)今世界上生存形式最為

5、嚴(yán)峻的群體。因此，為了保證兩棲類的種群延續(xù)和生態(tài)健康，從多水平研究?jī)?nèi)分泌干擾物對(duì)兩棲類生長(zhǎng)發(fā)育的影響已成為必然。本論文的目的是在研究西瑪津?qū)χ腥A大蟾蜍和非洲爪蟾的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生陽性有害影響的前提下，對(duì)其相關(guān)聯(lián)的分子水平的改變進(jìn)行研究。
　　本研究分別以本地種兩棲動(dòng)物中華大蟾蜍和模式種兩棲動(dòng)物非洲爪蟾為動(dòng)物模型，研究西瑪津?qū)@兩個(gè)物種生長(zhǎng)發(fā)育的影響、以及西瑪津?qū)Ψ侵拮傅母闻K相關(guān)基因（vtga2、ar、er、gr、hsp70、hsp9

6、0）表達(dá)水平和雄性性腺組織的雜交微陣列芯片表達(dá)譜的影響。通過基因表達(dá)的性能分析來探索介導(dǎo)外源雌激素對(duì)非洲爪蟾不利影響的分子路徑和細(xì)胞過程。初步推測(cè)西瑪津?qū)蓷惏l(fā)育毒性的信號(hào)通路和作用機(jī)制，為在分子水平的進(jìn)一步研究提供理論基礎(chǔ)。
　　中華大蟾蜍暴露西瑪津的實(shí)驗(yàn)設(shè)0.01％ DMSO對(duì)照組和4個(gè)西瑪津染毒組(0.1、1、10和100μg/L)。每個(gè)劑量組隨機(jī)挑選發(fā)育到第25/26期的正常蝌蚪144只蝌蚪，平均放入8個(gè)25×20×20

7、 cm3的平行缸中暴露85d。在暴露期間，每天記錄動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育情況、死亡數(shù)、變態(tài)情況;染毒結(jié)束后，進(jìn)行性腺的組織病理學(xué)切片的制作和觀察;對(duì)中華大蟾蜍的一般生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。結(jié)果顯示，10和100μgL西瑪津?qū)е轮腥A大蟾蜍蝌蚪死亡率顯著升高(p＜0.01，分別是對(duì)照組的2.17和2.86倍）;西瑪津?qū)χ腥A大蟾蜍的一般生長(zhǎng)情況（體重、體長(zhǎng)）無顯著性影響(p＞0.05);在各時(shí)間點(diǎn)對(duì)非洲爪蟾蝌蚪前腿發(fā)生的百分比無顯著性的抑制(

8、p＞0.05)，但10和100μg/L西瑪津使中華大蟾蜍蝌蚪后腿的伸展時(shí)間顯著延長(zhǎng)，與對(duì)照組相比分別延長(zhǎng)了2.1％(p＜0.05)和6.9％(p＜0.01);西瑪津抑制了中華大蟾蜍蝌蚪變態(tài)，各暴露組在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)皆有少數(shù)處于38-40期的發(fā)育異常個(gè)體;西瑪津?qū)е轮腥A大蟾蜍卵巢組織的卵細(xì)胞溶解、壞死，形成空泡，生殖細(xì)胞減少，睪丸組織中出現(xiàn)睪丸卵母細(xì)胞;西瑪津暴露組中出現(xiàn)了發(fā)育顯著遲緩無法辨認(rèn)性別的性腺;暴露組的中華大蟾蜍性別比與對(duì)照組的相比

9、未見顯著差異(p＞0.05);西瑪津暴露各組中均未見異常性腺形態(tài)。
　　非洲爪蟾暴露西瑪津的實(shí)驗(yàn)也設(shè)0.01％ DMSO對(duì)照組和4個(gè)西瑪津染毒組（0.1、1、10和100μg/L）。每個(gè)劑量組隨機(jī)挑選發(fā)育至46/47階段的健康蝌蚪120只，平均放入8個(gè)25×20×20 cm3的平行缸中暴露100 d。在暴露期間，每天記錄動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育情況、死亡數(shù)和變態(tài)情況。染毒結(jié)束后，制作非洲爪蟾性腺和肝臟的組織病理學(xué)切片并鏡下觀察;對(duì)爪蟾的一般

10、生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理;采用Q-RT-PCR對(duì)雌雄爪蟾肝臟相關(guān)基因表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè);在100μg/L西瑪津暴露組雄性非洲爪蟾的生殖系統(tǒng)生理學(xué)和毒理學(xué)終點(diǎn)具有顯著性改變的基礎(chǔ)上，采用非洲爪蟾全基因組芯片(Agilent Xenopus4x44K Gene ExpressionMicroarrays)對(duì)雄性非洲爪蟾性腺組織進(jìn)行基因表達(dá)譜研究。根據(jù)差異基因的功能角色和FC值，從結(jié)果中選取15個(gè)關(guān)鍵基因，采用Q-RT-PCR方法對(duì)表達(dá)譜數(shù)

11、據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證。然后，采用生物信息學(xué)技術(shù)GO分析和pathway分析對(duì)復(fù)雜的差異表達(dá)基因數(shù)據(jù)進(jìn)行處理轉(zhuǎn)換。尋求改變的生理學(xué)和毒理學(xué)終點(diǎn)與基因表達(dá)改變的關(guān)聯(lián)性。
　　西瑪津?qū)Ψ侵拮妇哂忻黠@的發(fā)育毒性。10和100μg/L西瑪津?qū)е路侵拮傅乃劳雎式员葘?duì)照組顯著升高64.3％(p＜0.05)。西瑪津?qū)Ψ侵拮傅捏w重和體長(zhǎng)沒有影響(p＞0.05)。10和100μg/L西瑪津使雄性非洲爪蟾的睪丸重量和GSI與對(duì)照組相比皆顯著下降57.1％(

12、p＜0.05)。雌性爪蟾的卵巢重量和GSI未受影響(p＞0.05);西瑪津沒有影響非洲爪蟾卵巢組織結(jié)構(gòu)的發(fā)育，但對(duì)睪丸組織結(jié)構(gòu)的影響顯而易見。暴露各組的睪丸切片中出現(xiàn)了不規(guī)則排列的曲細(xì)精管、腫脹的精原細(xì)胞和大量的空腔結(jié)構(gòu)。100μg/L組尤為顯著，出現(xiàn)精原細(xì)胞腫脹、部分曲細(xì)精管出現(xiàn)固縮和壞死、核濃染和片狀結(jié)構(gòu);暴露各組的睪丸組織中出現(xiàn)沿著頭尾軸不連續(xù)發(fā)育的異常節(jié)段;西瑪津沒有誘導(dǎo)非洲爪蟾產(chǎn)生性別比異常。分別統(tǒng)計(jì)暴露期的第60、70、80

13、和90 d西瑪津暴露各組中完全變態(tài)的非洲爪蟾數(shù)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在60和70 d時(shí)，西瑪津?qū)Ψ侵拮蛤蝌降淖儜B(tài)百分比無有顯著性的抑制(p＞0.05)，10μg/L西瑪津暴露組蝌蚪在第80d的時(shí)間點(diǎn)完全變態(tài)百分?jǐn)?shù)顯著低于對(duì)照組8.1％(p＜0.05)，第90 d的時(shí)間點(diǎn)爪蟾完全變態(tài)百分?jǐn)?shù)與對(duì)照組的相比差異更顯著(p＜0.01，低于22.2％);100μg/L西瑪津暴露組蝌蚪在第80天和90 d的時(shí)間點(diǎn)完全變態(tài)百分?jǐn)?shù)皆分別顯著低于對(duì)照組13.5

14、％和21.8％(p＜0.01)。同時(shí)，10和100μg/L西瑪津也顯著的延長(zhǎng)了蝌蚪完全變態(tài)所需要的天數(shù)(p＜0.01)。西瑪津暴露各組的雌雄爪蟾肝臟重量和HSI與對(duì)照組相比無顯著差異(p＞0.05)，但各暴露組雄性爪蟾的HSI出現(xiàn)了小于雌性的趨勢(shì);10和100μg/L西瑪津?qū)е赂闻K組織出現(xiàn)溶解、壞死，肝臟細(xì)胞萎縮。只有0.1μg/L西瑪津顯著誘導(dǎo)了雌性爪蟾肝臟中的hsp70的表達(dá)(p＜0.05)，肝臟組織中的vtga2、hsp90、ar

15、、er、gr基因表達(dá)量未被顯著影響。
　　篩選出對(duì)非洲爪蟾生殖發(fā)育影響最大的西瑪津濃度是100μg/L，且作為內(nèi)分泌干擾物西瑪津?qū)π坌苑侵拮傅挠绊懘笥诖菩?，由此，選擇雄性非洲爪蟾作為分子實(shí)驗(yàn)部分的動(dòng)物模型。全基因組芯片結(jié)果顯示，在100μg/L西瑪津暴露組的睪丸組織中共有1315個(gè)差異基因，其中上調(diào)基因454個(gè)，下調(diào)基因861個(gè)(FC＞=2且p＜=0.05)。芯片的原始數(shù)據(jù)已上傳到NCBI Gene Expression Omn

16、ibus，序列號(hào)為17214940;采用Q-RT-PCR方法對(duì)選取基因進(jìn)行驗(yàn)證的結(jié)果與表達(dá)譜結(jié)果一致;差異表達(dá)基因的GO分析結(jié)果顯示，與生物過程相關(guān)的有188個(gè)注釋條目，與細(xì)胞組成相關(guān)的有37個(gè)注釋條目，與分子功能相關(guān)的有33個(gè)注釋條目;通過差異基因的pathway分析，本次實(shí)驗(yàn)篩選出5條顯著性富集差異基因的通路，分別是精氨酸和脯氨酸代謝通路、丙氨酸、谷氨酸和天冬氨酸代謝通路、核黃素代謝通路、細(xì)胞周期通路、色氨酸代謝通路。
　　本

17、研究確認(rèn)了西瑪津?qū)蓷愔腥A大蟾蜍和非洲爪蟾的發(fā)育毒性。高劑量的西瑪津增加了兩棲類的死亡率，降低了GSI，對(duì)性腺和肝臟的組織結(jié)構(gòu)產(chǎn)生損傷，延遲或抑制了兩棲類的變態(tài)，從兩種兩棲動(dòng)物的毒理學(xué)數(shù)據(jù)比較來看，中華大蟾蜍對(duì)西瑪津更加敏感;西瑪津?qū)Ψ侵拮父闻K組織基因表達(dá)的無影響，可能是由于長(zhǎng)期暴露導(dǎo)致機(jī)體的調(diào)節(jié)適應(yīng)，抑或與肝細(xì)胞損傷有關(guān);詳細(xì)研究了與非洲爪蟾生理學(xué)和毒理學(xué)終點(diǎn)改變相關(guān)聯(lián)的分子水平的變化。差異基因分析結(jié)果暗示，西瑪津?qū)π坌苑侵拮覆?/p>

18、是通過誘導(dǎo)芳化酶表達(dá)實(shí)現(xiàn)雌激素效應(yīng)的。同時(shí)，也未干擾雌激素受體和雄激素受體信號(hào)通路。生殖系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)中的差異基因42Sp50，Zpax，wees，acps，ptgs2,th，stc1與西瑪津?qū)е碌男坌苑侵拮傅纳扯拘孕?yīng)密切相關(guān)。綜合分析推測(cè)，西瑪津主要通過干擾與類固醇分泌相關(guān)的基因的表達(dá)，從而引起身體的組織發(fā)育和生理功能異常。西瑪津?qū)π坌苑侵拮傅亩拘宰饔媚Ｊ胶苡锌赡苁且环N綜合的新陳代謝調(diào)節(jié)模式。總之，本研究確認(rèn)了西瑪津?qū)Ρ镜胤N

19、中華大蟾蜍和模式動(dòng)物非洲爪蟾的發(fā)育影響，以及參與雄性非洲爪蟾生殖系統(tǒng)生理學(xué)和毒理學(xué)終點(diǎn)改變的眾多基因和信號(hào)通路，為進(jìn)一步研究西瑪津生殖毒性的分子作用機(jī)理提供數(shù)據(jù)支持。使我們能夠通過西瑪津?qū)蓷惿嘲l(fā)育的影響，預(yù)知和推測(cè)其對(duì)人類生殖發(fā)育的危害。對(duì)制定西瑪津在我國(guó)環(huán)境中殘留的安全標(biāo)準(zhǔn)、建立環(huán)境監(jiān)測(cè)方法和發(fā)育毒性的預(yù)防策略都有著很高的科學(xué)參考價(jià)值，最終為建立和完善具有中國(guó)特色，并與國(guó)際接軌的環(huán)境雌激素安全標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)體系和數(shù)據(jù)庫(kù)奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)