n-[4-(4,6二甲基-2-嘧啶氧基)-3-甲基苯基]-N’-[2-(二甲氨基)]苯甲酰脲的抗腫瘤作用及作用機(jī)制.pdf

1、N-[4-（4，6二甲基-2-嘧啶氧基）-3-甲基苯基]-N'-[2-（二甲氨基）]苯甲酰脲(SUD)是新合成的苯甲酰脲類化合物，它的抗腫瘤作用及其機(jī)制尚未了解，因此本論文旨在研究SUD對于腫瘤的作用及其機(jī)制。本文主要從以下幾部分展開論述:
　　第一部分 SUD對細(xì)胞生長的影響
　　目的:檢測SUD對正常細(xì)胞株、腫瘤細(xì)胞株和腫瘤多藥耐藥細(xì)胞株的生長抑制作用。
　　方法:采用MTT實驗法檢測SUD對人正常肝細(xì)胞L-02、

2、人胃黏膜細(xì)胞GES-1、人肺癌細(xì)胞株A549和H1299、人胃癌細(xì)胞株BGC-803和BGC-823、人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和MDAMB-231、人卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3、人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721和人耐藥乳腺癌細(xì)胞MCF-7-ADR的影響。
　　結(jié)果:
　　1.SUD對人胃黏膜細(xì)胞GES-1細(xì)胞和人正常肝細(xì)胞L-02細(xì)胞的生長抑制作用很弱。只有在100μMSUD作用于人正常胃黏膜細(xì)胞GES-1細(xì)胞和人正常肝細(xì)胞L-

3、02細(xì)胞72小時后才有抑制作用，但其抑制率只有（14.8±1.1）％和(21.1±1.2)％（P＜0.05）。100μM陽性對照藥紫杉醇作用于人正常胃黏膜細(xì)胞GES-1細(xì)胞72小時的抑制率高達(dá)（93.8±1.0）％，與之相比，100μMSUD作用于人正常胃黏膜細(xì)胞GES-1細(xì)胞72小時的抑制率要低得多（P＜0.01）。
　　2.SUD可時間和濃度依賴性抑制人胃癌細(xì)胞株BGC-803和BGC-823、人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和MDA

4、MB-231和人卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3的生長，SUD可濃度依賴性抑制人肺癌細(xì)胞株A549和H1299、人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721的生長，作用72小時后，對BGC-803、BGC-823、MCF-7、MDAMB-231和SKOV-3的IC50(μM)分別為(1.45±0.96)、（1.17±0.73）、（0.42±0.03）、（1.29±0.91）和（8.39±0.90）;而對A549、H1299和SMMC-7721的IC50均大于

5、100μM，可見SUD對乳腺癌和胃癌細(xì)胞的生長抑制作用強(qiáng)于肺癌、卵巢癌和肝癌細(xì)胞(P＜0.05)。
　　3.SUD可時間和濃度依賴性抑制MCF-7-ADR的生長，作用48小時和72小時后，對MCF-7-ADR的IC50（μM）分別為0.95±0.46和0.57±0.19(P＜0.05)。
　　結(jié)論:SUD可時間和濃度依賴性抑制多種腫瘤的生長，對耐藥腫瘤株也有抑制生長的作用，而對正常細(xì)胞的生長抑制作用較弱。
　　第二部分

6、 SUD對微管蛋白的影響
　　目的:研究SUD對微管蛋白的影響
　　方法:采用微管聚合實驗考察SUD對微管蛋白聚合和聚合的影響;采用免疫細(xì)胞化學(xué)、共聚焦技術(shù)研究SUD對β-tubulin的影響。
　　結(jié)果:
　　1.根據(jù)微管蛋白聚合實驗結(jié)果可知，經(jīng)過SUD處理的微管蛋白的聚合和解聚的程度降低了。
　　2.根據(jù)免疫細(xì)胞化學(xué)和共聚焦技術(shù)的結(jié)果可知，經(jīng)過SUD處理的MCF-7細(xì)胞中的β-tubulin的熒光強(qiáng)度下

7、降。
　　結(jié)論:SUD抗腫瘤作用的其中一個機(jī)制為抑制微管聚合和解聚。
　　第三部分 SUD對乳腺癌和胃癌細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制的研究
　　目的:研究SUD對乳腺癌和胃癌細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制
　　方法:采用克隆形成實驗考察SUD對乳腺癌和胃癌細(xì)胞增殖的影響;采用流式細(xì)胞術(shù)考察SUD對乳腺癌和胃癌細(xì)胞周期的影響;采用Westernblot及實時熒光定量PCR研究了細(xì)胞周期相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)。
　　結(jié)果:

8、r>　　1.根據(jù)平板克隆實驗結(jié)果可知，培養(yǎng)14天后，MCF-7細(xì)胞的克隆形成率為（59.54±1.07）％，0.2μmol/L、1μmol/L、5μmol/L的SUD處理組的克隆形成率分別降至（16.83±1.48）％、(14.67±0.05)％和(0.81±0.03)％(P＜0.05);培養(yǎng)14天后BGC-823細(xì)胞有(69.89±2.76)％的克隆形成率，0.2μmol/L、1μmol/L、5μmol/L的SUD處理組的克隆形成率分

9、別降至(26.25±1.13)％、(23.08±1.07)％和(2.25±0.92)％(P＜0.05)。
　　2.SUD可引起MCF-7細(xì)胞G2期阻滯和BGC-823細(xì)胞G1期阻滯(P＜0.05)。
　　3根據(jù)Western blot和實時熒光定量PCR分析細(xì)胞周期相關(guān)的基因和蛋白的表達(dá)的結(jié)果可知，在基因和蛋白水平上，SUD均可以濃度依賴性地上調(diào)p53和Chk1的表達(dá)，下調(diào)CDK4、Cdc25a、Cyclin B1和CDK1

10、的表達(dá)(P＜0.05)。
　　結(jié)論:SUD可抑制乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和胃癌細(xì)胞株BGC-823的增殖，其抑制作用與引起細(xì)胞周期阻滯有關(guān)，引起細(xì)胞阻滯可能與p53和Chk1的表達(dá)的上調(diào)， CDK4、Cdc25a、Cyclin B1和CDK1的表達(dá)的下調(diào)有關(guān)。
　　第四部分 SUD對乳腺癌和胃癌細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制研究
　　目的:研究SUD對乳腺癌和胃癌細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制
　　方法:采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測S

11、UD對腫瘤細(xì)胞靜息電位的影響;采用Hoechest33258染色實驗考察SUD對乳腺癌和胃癌細(xì)胞細(xì)胞核的影響;采用ROS染色實驗考察SUD對乳腺癌和胃癌細(xì)胞中ROS的影響;采用SOD試劑盒、MDA試劑盒考察SUD對乳腺癌和胃癌細(xì)胞中SOD和MDA生成的影響;采用Western blot研究細(xì)胞凋亡及其相關(guān)蛋白和基因表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:
　　1.SUD能夠顯著性引起細(xì)胞膜電位發(fā)生改變，可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞膜靜息膜電位向去極化方向

12、移動。
　　BGC-823細(xì)胞靜息膜電位-78±5mV，灌流5μM SUD后變?yōu)?-26±4) mV。0.2μM SUD作用48小時后BGC-823細(xì)胞靜息膜電位升至(-60±6)mV，1μM SUD作用48小時后BGC-823細(xì)胞靜息膜電位升至(-40±5)mV，5μM SUD作用48小時后BGC-823細(xì)胞靜息膜電位升至(-15±4)mV。MCF-7細(xì)胞靜息膜電位（-84±7）mV，灌流5μM SUD后變?yōu)椋?21±4）mV。

13、0.2μM SUD作用48小時后MCF-7細(xì)胞靜息膜電位升至(-65±7) mV，1μM SUD作用48小時后MCF-7細(xì)胞靜息膜電位升至（-48±5）mV，5μM SUD作用48小時后MCF-7細(xì)胞靜息膜電位升至(-10±3)mV。
　　2.根據(jù)Hoechst33258染色結(jié)果可知SUD可引起細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)凝集等細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變。
　　3.ROS的生成隨著SUD濃度的升高而增多。
　　4.SOD的活力隨著SU

14、D濃度的升高而下降。
　　5.SUD濃度濃度依賴性地增多MDA的生成。
　　6.SUD濃度依賴性地增加Bax蛋白表達(dá)并提高Bax/Bcl-2的比值，下調(diào)Bcl-2、caspase-3和caspase-9的表達(dá)，上調(diào)cleaved caspase-3和cleavedcaspase-9的表達(dá)。
　　結(jié)論:SUD可以誘導(dǎo)乳腺癌和胃癌細(xì)胞凋亡，SUD引起細(xì)胞膜電位的改變。SUD誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能是上調(diào)促凋亡基因p53和

15、Bax與Bcl-2的比例、增加ROS和MDA的生成、降低SOD的活性，從而啟動凋亡信號，通過激活線粒體通路，從而活化caspase-9和caspase-3而誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。
　　第五部分 SUD對乳腺癌和胃癌細(xì)胞遷移的影響及其機(jī)制研究
　　目的:研究SUD對乳腺癌和胃癌細(xì)胞遷移的影響及其機(jī)制
　　方法:采用劃痕實驗觀察SUD對腫瘤細(xì)胞遷移能力的影響;采用F-actin染色實驗考察SUD對腫瘤細(xì)胞中F-actin的

16、影響;采用Western blot用于研究SUD對TRPM7的表達(dá)的影響;采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測SUD對腫瘤細(xì)胞中的TRPM7電流的作用;實時熒光定量PCR用于研究SUD對PI3K、AKT和TRPM7基因的表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:
　　1.劃痕實驗結(jié)果顯示，SUD抑制細(xì)胞遷移并使EGF對細(xì)胞遷移的促進(jìn)作用減弱。
　　2.F-actin染色實驗結(jié)果顯示，SUD可濃度依賴性的使F-actin的表達(dá)下降(P＜0.05)，也

17、可濃度依賴性阻斷EGF的作用(P＜0.05)。
　　3.Western blot分析細(xì)胞中TRPM7的蛋白的表達(dá)的結(jié)果顯示，SUD濃度依賴性地使TRPM7的蛋白表達(dá)減少(P＜0.05)。
　　4.全細(xì)胞膜片鉗實驗結(jié)果顯示，記錄到的MCF-7和BGC-823細(xì)胞中的TRPM7電流在正電壓下表現(xiàn)為具有顯著外向整流特性的較大電流幅度的外向電流，在負(fù)電壓下幾乎沒有電流。SUD孵育48小時后，SUD濃度依賴性地使TRPM7電流幅度明顯