紅色紅曲菌mrr基因的克隆與功能初步研究.pdf

1、紅曲菌（Monascus spp．）是用來發(fā)酵生產(chǎn)紅曲的微生物，它能夠產(chǎn)生紅曲色素、Monacolin K、γ-氨基丁酸（γ-amino butyric acid，GABA）、麥角固醇等生理活性物質(zhì)，具有較高的商業(yè)價值。目前，國內(nèi)外關(guān)于紅曲菌的研究主要集中在菌種分類、選育，發(fā)酵條件研究，桔霉素檢測等方面，關(guān)于其分子生物學的研究剛剛起步，其功能基因研究主要集中于色素、桔霉素和Monacolin K代謝調(diào)控途徑等方面。
　　 雙組分

2、系統(tǒng)是細菌、植物與真菌中均存在的一種信號傳導途徑，其包含組氨酸蛋白激酶與應答調(diào)節(jié)蛋白兩個組分。研究表明，雙組分系統(tǒng)在絲狀真菌中與氧化應激應答、滲透壓應答及孢子形成有關(guān)。目前為止，在紅曲菌中關(guān)于雙組分系統(tǒng)的研究尚未見報道。
　　 本實驗室前期采用根癌農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化方法建立了包含10000多株T-DNA突變子的紅色紅曲菌（M．ruber）M-7轉(zhuǎn)化庫。本實驗從轉(zhuǎn)化庫中選出8株T-DNA插入突變子，并對其菌落形態(tài)和顯微形態(tài)進行了觀察

3、。在此基礎(chǔ)上，采用TAIL-PCR分離得到4株突變子的T-DNA側(cè)翼序列，并利用SON-PCR．對其中1株突變子DNA序列進行了延伸，總共獲得5個基因，發(fā)現(xiàn)其中一個基因mrr的編碼蛋白與曲霉屬（Aspergillus spp．）壓力應答調(diào)節(jié)蛋白高度同源，利用基因敲除的方法對其功能進行了初步研究，主要研究內(nèi)容如下：
　　 1紅色紅曲菌突變子T-DNA側(cè)翼序列的克隆
　　 通過對143株T-DNA插入突變子與出發(fā)菌株M-7菌

4、落形態(tài)進行比較，篩選得到8株菌落形態(tài)發(fā)生變化的突變子并對其顯微形態(tài)進行了觀察。采用TAIL-PCR法對上述8株突變子T-DNA插入位點的側(cè)翼序列進行了擴增，得到了3192＃、3440＃、2341＃、3725＃4株突變子T-DNA插入位點側(cè)翼序列。其中，突變子3192＃擴增序列726bp，與構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）壓力應答調(diào)節(jié)蛋白編碼基因重疊101bp。利用SON-PCR對此序列進行延伸后獲得全長為13649b

5、p的DNA序列。此序列共包含5個基因，其編碼氨基酸序列分別與曲霉屬Cog6、Nil3蛋白、BolA蛋白、AhpC/TSA家族蛋白及壓力應答調(diào)節(jié)蛋白的同源性達到80％以上。
　　 2 mrr基因敲除
　　 壓力應答調(diào)節(jié)蛋白編碼基因全長2356bp，包含6個外顯子，5個內(nèi)含子，預測蛋白含634個氨基酸，具有一個保守的接受結(jié)構(gòu)域和一個DNA結(jié)合區(qū)，這兩者是應答調(diào)節(jié)蛋白的基本原件。推測該基因可能是紅色紅曲菌雙組分系統(tǒng)中應答調(diào)節(jié)蛋

6、白編碼基因，將其命名為mrr（Monascus ruber response regulator）。構(gòu)建mrr基因敲除載體pCMRR，并利用農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化的方法成功獲得3株△mrr突變子。
　　 3 mrr功能初步研究
　　 對△mrr突變子的性狀進行了初步的研究，發(fā)現(xiàn)mrr基因的缺失使得紅曲菌的生長速度加快，有性發(fā)育滯后。Mrr基因的缺失對于紅曲菌耐滲特性影響不顯著，但其缺失使得紅曲菌對外界氧化壓力的敏感性增大，△mr