非洲豬瘟病毒膠體金免疫層析試紙條的研制.pdf

1、非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的豬的一種急性、烈性、高度接觸性傳染性疾病。其臨床特征主要為全身出血、呼吸障礙和神經(jīng)癥狀，發(fā)病率和死亡率高，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的危害巨大。且目前尚無(wú)有效的疫苗用于該病的預(yù)防，主要通過(guò)檢疫后撲殺來(lái)控制其爆發(fā)和流行。因此，建立科學(xué)有效的檢測(cè)診斷方法對(duì)于非洲豬瘟的防范具有重要意義。
　　為獲得ASFV P7

2、2融合蛋白，本研究利用前期研究中構(gòu)建的重組菌株pET-30a-P72(BL21)接種到LB液體培養(yǎng)基，以IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)后，收集菌體并以超聲波進(jìn)行裂解，裂解物經(jīng)SDS-PAGE分析，證明了該P(yáng)72融合蛋白可以在大腸桿菌BL21中大量表達(dá)。通過(guò)免疫印記技術(shù)分析可知，該融合蛋白可以與鼠抗His標(biāo)簽單抗特異性反應(yīng)，將表達(dá)的P72重組蛋白經(jīng)His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒純化后免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體。復(fù)蘇本實(shí)驗(yàn)室保存的抗ASFV的雜交瘤細(xì)胞株2

3、D3，擴(kuò)大培養(yǎng)后接種于10周齡以上經(jīng)產(chǎn)BALB/c小鼠，采用體內(nèi)腹水誘生法制備了含有抗ASFV單抗的腹水。
　　將收集的ASFV抗體分別經(jīng)飽和硫酸銨法、辛酸—硫酸銨聯(lián)合沉淀法、protein G柱親和層析法進(jìn)行純化，對(duì)純化后的抗體經(jīng)SDS-PAGE比較分析，最終選擇純化效果較好的protein G柱親和層析法。純化后的抗體經(jīng)紫外分光光度儀測(cè)定濃度，并用已建立的間接ELISA法測(cè)定其效價(jià)，單抗為1∶160000，多抗為1∶51200

4、。
　　為制備ASFV膠體金免疫層析試紙條，研究中采用直徑為30nm的膠體金顆粒標(biāo)記純化后的單抗2D3作為金標(biāo)抗體，以純化后的多抗固定于NC膜上作為檢測(cè)線，其最佳濃度為1.47mg/mL;將葡萄球菌A蛋白(SPA)固定于NC膜上作為質(zhì)控線，其最佳濃度為1.0mg/mL，組裝成用于檢測(cè)ASFV的膠體金免疫層析試紙條。以pET-30a和PGEX-6P-1為載體表達(dá)的ASFV P72蛋白（簡(jiǎn)稱P3P蛋白和PXP蛋白）作為陽(yáng)性樣品，PBS