視黃醇對仔豬睪丸支持細胞體外生物學特性的影響.pdf

1、視黃醇及其代謝產物是雄性動物睪丸發(fā)育和精子發(fā)生所必需的物質。支持細胞是睪丸內視黃醇作用的靶細胞，為生精細胞發(fā)育和成熟提供特有的微環(huán)境。本試驗以分離自3-5周齡仔豬睪丸的支持細胞為材料，采用RT-PCR、CCK-8、ELISA檢測支持細胞內增殖和凋亡相關基因、細胞因子的表達，分析視黃醇對仔豬睪丸支持細胞增殖、凋亡和表達細胞因子的影響，獲得如下結果:
　　1.仔豬支持細胞的分離培養(yǎng)和鑒定
　　經比較3組酶消化法所獲得細胞數量、細

2、胞活率和GATA-4 mRNA相對表達量，結果顯示，先以0.25％膠原酶Ⅳ和0.1％透明質酸酶，37℃消化60 min，再以0.25％胰酶和0.1％DNaseⅠ，37℃消化20 min，有利于支持細胞的富集。于貼壁不同時間收集細胞，分析懸浮細胞和貼壁細胞中GATA-4 mRNA相對表達量，結果顯示，支持細胞在2h內不貼壁，貼壁時間主要分布在3～5 h。采用差異貼壁和低滲處理后純化細胞，形態(tài)不規(guī)則，胞體寬大，細胞核呈卵圓或不規(guī)則形;GAT

3、A4染色呈陽性，堿性磷酸酶染色呈陰性;RT-PCR檢測結果顯示，純化后細胞表達支持細胞標記GATA4、SOX9、INHB，不表達間質細胞標記CYP17、3β-HSD和管周細胞標記α-SMA，符合支持細胞的驀本特征;經ELISA檢測顯示，本試驗所分離支持細胞表達GDNF、LIF、CSF-1、FGF2、EGF，而SCF未檢出。
　　2.視黃醇對支持細胞增殖和凋亡的影響
　　分別在培養(yǎng)基中添加0.005μmol/L、0.025μm

4、ol/L、0.125μmol/L、0.625μmol/L、1.25μmol/L、2.5μmol/L、5μmol/L和10μmol/L視黃醇，短期培養(yǎng)(24h)和長期培養(yǎng)(3d)后，經CCK-8檢測支持細胞活性，結果如下:培養(yǎng)24h，視黃醇濃度低于5μmol/L，對支持細胞的活性沒有顯著影響，而濃度達到5μmol/L顯著抑制支持細胞活性，表明5μmol/L及以上濃度的視黃醇對支持細胞具有顯著的細胞毒性效應;培養(yǎng)3d，視黃醇濃度低于為0.0

5、05μmol/L和0.025μmol/L時對支持細胞活性無顯著影響，視黃醇濃度為0.125μmol/L和0.625μmol/L時顯著抑制支持細胞活性(P＜0.05)，濃度達到1.25μmol/L時表現極顯著抑制(P＜0.01)。短期培養(yǎng)和長期培養(yǎng)結果顯示，視黃醇的作用具有時效性和劑量依賴性。
　　實驗選取1.25μmol/L作為視黃醇的試驗濃度，應用RT-PCR檢測分析視黃醇對細胞增殖(PCNA、C-MYC和BCL-2)和凋亡相關

6、基因(CASP3和BAX)表達的影響，結果顯示:視黃醇組增殖相關基因的表達量顯著低于對照組，凋亡相關基因的表達量顯著高于對照組。結果表明視黃醇通過抑制支持細胞內增殖相關基因表達，促進凋亡相關基因表達，進而抑制支持細胞增殖。
　　3.視黃醇對支持細胞分泌細胞因子的影響
　　在培養(yǎng)基中添加1.25μmol/L視黃醇，應用RT-PCR分析和ELISA檢測分析視黃醇對支持細胞表達細胞因子的影響，RT-PCR分析顯示，視黃醇顯著抑制支