小麥DREB轉(zhuǎn)錄因子的分子生物學(xué)特性分析及功能鑒定.pdf

1、AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子基因家族的成員廣泛存在于擬南芥、小麥、玉米、煙草和水稻等各種植物中，并參與調(diào)控各種功能基因的表達(dá)，其中DREB轉(zhuǎn)錄因子在抗逆應(yīng)答反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。本研究的目的是對(duì)本實(shí)驗(yàn)室已克隆的小麥DREB基因，進(jìn)行系統(tǒng)的分子生物學(xué)特性和功能鑒定，為研究小麥的抗逆分子機(jī)理及抗逆基因工程提供科學(xué)依據(jù)。 (1)對(duì)小麥材料進(jìn)行各種脅迫處理(干旱、高鹽、低溫和ABA)，提取總RNA，純化，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，運(yùn)用RT-PCR

2、技術(shù)對(duì)DREB轉(zhuǎn)錄因子基因進(jìn)行表達(dá)特性分析。結(jié)果表明，TaDREB3、TaDREB9、TaDREB10、W42基因受干旱、高鹽、低溫和ABA的誘導(dǎo)，TaDREB6基因受干旱脅迫誘導(dǎo)，但它們對(duì)各種脅迫響應(yīng)的時(shí)間不一樣。表明TaDREB3、TaDREB9、TaDREB10、W42基因在小麥植株對(duì)干旱、高鹽、低溫和ABA的應(yīng)答反應(yīng)中起重要作用。 (2)把目的基因插入到35S啟動(dòng)子和綠色熒光蛋白(GFP)基因之間，構(gòu)建DREB轉(zhuǎn)錄因子的

3、亞細(xì)胞定位重組載體。通過(guò)基因槍法轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞，暗培養(yǎng)24 h后共聚焦顯微鏡下觀察，驗(yàn)證DREB基因是否具有核定位功能。研究結(jié)果表明，TaDRF1、TaDREB3、W42、TaDREB6蛋白僅在核內(nèi)產(chǎn)生綠色熒光，能定位于細(xì)胞核，可通過(guò)自身的NLS轉(zhuǎn)位入核行使功能；TaDREB9、TaDREB10蛋白在細(xì)胞核內(nèi)和細(xì)胞質(zhì)中都可以觀察到GFP的綠色熒光信號(hào)，說(shuō)明TaDREB9、TaDREB10蛋白不具有核定位的功能，可能靠與具有NLS區(qū)的轉(zhuǎn)

4、錄因子相互作用進(jìn)入細(xì)胞核。 (3)利用酵母單雜交的方法，將基因cDNA的編碼區(qū)插入到酵母表達(dá)載體YepGAP中，將其分別轉(zhuǎn)化到含報(bào)告基因HIS3和LacZ的野生型DRE或突變型DRE的酵母菌株中，觀測(cè)轉(zhuǎn)化的重組酵母菌株在含不同濃度的3.AT的SD選擇培養(yǎng)基(His-/Ura-/Tyr-)上的生長(zhǎng)情況，利用半乳糖苷酶顯色反應(yīng)對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活活性進(jìn)一步確認(rèn)。試驗(yàn)結(jié)果表明，W42、TaDRF1、TaDREB2、TaDREB3、Ta

5、DREB9、TaDREB10具有特異結(jié)合DRE元件的活性和轉(zhuǎn)錄激活下游基因表達(dá)的功能。 (4)構(gòu)建雙子葉轉(zhuǎn)基因載體，通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化把W42基因轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌C58C1，農(nóng)桿菌真空侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥，收集轉(zhuǎn)基因當(dāng)代植株的種子(T0代)，在Kana-MS培養(yǎng)基上篩選，獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥，對(duì)W42轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行干旱、滲透和高鹽脅迫抗性分析。結(jié)果表明，W42的過(guò)表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)干旱、滲透和高鹽的抗性。 (5)以中國(guó)春缺體．四體為

6、材料，采用基因特異性引物PCR進(jìn)行TaDREB6基因的染色體定位。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以NT 3A/3B缺體-四體材料為模板的PCR反應(yīng)體系中，無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物生成，而在中國(guó)春和其他缺體一四體材料的反應(yīng)體系中，均產(chǎn)生一條與目的片段大小一致的帶，說(shuō)明TaDREB6基因定位于3A染色體上。這些研究結(jié)果為深入了解DREB基因調(diào)控植物脅迫應(yīng)答反應(yīng)的分子機(jī)理提供了理論基礎(chǔ)，為研究小麥的抗逆分子機(jī)理及抗逆基因工程提供科學(xué)依據(jù)，為利用基因工程的方法改良作物的抗逆性提