以枯草桿菌芽孢呈遞系統(tǒng)為基礎(chǔ)的新型流感疫苗基礎(chǔ)研究.pdf

1、目的:本研究利用枯草桿菌芽孢展示外源抗原的芽孢呈遞技術(shù),制備出表面展示流感病毒保守抗原M2蛋白胞外區(qū)(M2e)的重組芽孢,并作為流感病毒新型候選疫苗開展動物實驗,對其免疫原性及免疫保護效果進行分析與評價,為發(fā)展以枯草桿菌芽孢呈遞系統(tǒng)為基礎(chǔ)的新型流感疫苗奠定研究基礎(chǔ)。
　　方法:(1)將枯草桿菌CotB基因構(gòu)建到基因組整合質(zhì)粒pDG1664中,再將3個串聯(lián)的M2e分子基因連接到CotB基因的下游,構(gòu)建成重組質(zhì)粒pDG1664-Cot

2、B-M2e3;通過同源重組的方式,將外源基因CotB-M2e3整合到PY79枯草桿菌基因組中。利用紅霉素抗性篩選重組菌并挑取重組子單菌落進行培養(yǎng),提取基因組以PCR擴增和測序方式鑒定是否正確整合了M2e抗原基因;通過SDS-PAGE、WesternBlot鑒定芽孢蛋白中流感病毒M2e抗原的表達情況,并采用流式細胞術(shù)和免疫熒光方法進一步確定M2e抗原在芽孢表面的表達。利用形態(tài)學(xué)觀察、APICH50和API20E生化實驗及16srRNA分析

3、等實驗對重組芽孢的生長狀態(tài)、生化特征等進行了分析和鑒定。(2)為了進一步分析表達流感M2e的重組芽孢的免疫原性和免疫保護性,我們應(yīng)用表達流感M2e的重組芽孢進行動物免疫和動物攻毒實驗。在不使用佐劑的情況下用重組芽孢直接口服免疫小鼠,首次連續(xù)口服免疫3天,待首次免疫4周后再連續(xù)免疫3天,之后于距首次免疫5周時進行末次免疫,分別在首次免疫后5、7、9、11、13、15、17周尾靜脈采血并分離血清進行體液免疫反應(yīng)的檢測和分析;同時利用流式細胞

4、術(shù)檢測細胞免疫水平;通過攻毒保護性試驗對這種新型候選疫苗進行免疫保護性評價。
　　結(jié)果:(1)表達流感病毒M2e的重組枯草桿菌芽孢的制備及鑒定:優(yōu)化條件后,采用電轉(zhuǎn)化方法將pDG1664-CotB-M2e3重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至PY79感受態(tài)菌;轉(zhuǎn)化菌經(jīng)PCR檢測和基因測序鑒定表明,重組芽孢基因組中正確整合了M2e抗原基因。重組芽孢經(jīng)SDS-PAGE和WesternBlot分析證實,流感病毒M2e抗原在重組芽孢中成功表達;采用流式細胞術(shù)和

5、免疫熒光方法檢測進一步確定了M2e抗原表達呈遞在重組芽孢表面,形成的重組芽孢表面蛋白(CotB-M2e融合蛋白)分子量約為37kDa。實驗研究表明,我們成功制備出整合了M2e基因重組枯草芽孢菌株(命名RSM2e31)。利用電子顯微鏡檢測技術(shù)及重組芽孢傳代培養(yǎng),進行重組芽孢形態(tài)學(xué)觀察和分析,實驗結(jié)果表明重組菌株RSM2e31能與野生株一樣形成芽孢,并且外源基因能夠在重組桿菌芽孢中穩(wěn)定存在;對重組芽孢菌進行的生化反應(yīng)(APICH50及API

6、20E)實驗及16srRNA測序結(jié)果分析表明,重組株仍屬于枯草芽孢桿菌屬。重組芽孢的生長狀態(tài)如菌落形成和生化反應(yīng)等雖然與野生枯草芽孢桿菌有稍許變化,但重組株的基本生化特性與野生株具有較好的一致性。
　　(2)表達流感病毒M2e的重組枯草桿菌芽孢免疫原性及免疫反應(yīng)特征分析:為了進一步分析表達流感M2e的重組芽孢的免疫原性和觀察其免疫反應(yīng)特征,本研究采用口服免疫的方式免疫小鼠進行實驗研究。小鼠免疫實驗結(jié)果表明,RSM2e31重組芽孢不

7、添加佐劑進行口服免疫能夠誘導(dǎo)出良好的體液免疫應(yīng)答,并且免疫后17周抗體水平處于較高的水平(1:11200)。抗體亞類分析表明重組芽孢誘導(dǎo)的IgG抗體以IgG1為主。進一步取免疫小鼠脾細胞進行的胞內(nèi)細胞因子流式檢測發(fā)現(xiàn),RSM2e31重組芽孢免疫可以有效誘導(dǎo)M2e抗原特異性Th2型細胞免疫應(yīng)答。小鼠肺和腸灌洗液sIgA檢測發(fā)現(xiàn),重組芽孢還能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生一定的粘膜免疫應(yīng)答。
　　(3)表達流感病毒M2e的重組枯草桿菌芽孢疫苗的攻毒保

8、護性實驗研究:采用A/PR/8/34(H1N1)流感病毒以103TCID50劑量對免疫后17周小鼠進行攻毒保護性實驗。野生株芽孢免疫組、PBS對照免疫組小鼠的存活率僅為10％,而RSM2e31重組芽孢免疫小鼠全部存活。肺組織病毒滴度檢測發(fā)現(xiàn),RSM2e31重組芽孢免疫小鼠肺組織病毒滴度顯著降低,表明體內(nèi)病毒復(fù)制得到有效抑制。由此可見,RSM2e31重組芽孢具有良好的免疫保護作用。
　　結(jié)論:本研究針對流感病毒M2e保守性抗原建立了