高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒抑制B2M基因表達的分子機制及其生物學意義.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染所引起的，主要導致母豬的繁殖障礙和仔豬的呼吸道疾病，同時該病具有免疫抑制和免疫逃逸的特性，有多種策略來逃避宿主的免疫清除作用和抑制宿主的免疫應答，造成持續(xù)性感染。主要組織相容性復合體Ⅰ(MHC-Ⅰ)存在于所有有核細胞的表面，主要參與內源性抗原的提呈，特別是病毒抗原。MHC-Ⅰ將經(jīng)過加工的

2、病毒抗原提呈至感染細胞表而，從而被CD8+T淋巴細胞所識別，活化的CD8+細胞毒性T淋巴細胞可以有效的清除被感染細胞，完成對病毒的清除作用。豬白細胞抗原Ⅰ(SLA-Ⅰ)是豬的主要組織相容性復合體Ⅰ類分子，也是由重鏈和β2m構成，其中β2m具有維持MHC-Ⅰ結構穩(wěn)定的功能，而且在MHC-Ⅰ與抗原多肽的結合中發(fā)揮重要作用。自然界中，多種病毒具有不同的機制來干擾宿主對病毒抗原的提呈來逃避機體的免疫清除。而且有研究報道，PRRSV可以通過增加M

3、HC-Ⅰ分子的泛素蛋白酶體降解來實現(xiàn)下調肺泡巨噬細胞(PAMs)表面MHC-Ⅰ分子的表達。為了進一步解析PRRSV下調細胞表面表面MHC-Ⅰ分子表達的機制，開展了本文的研究，希望能夠通過更多研究來對PRRSV的免疫抑制和免疫逃逸機制提供更多樣化的科學解釋。
　　首先，利用流式細胞術和間接免疫熒光的方法分析了PRRSV可以導致專職的抗原提呈細胞如PAMs、骨髓來源的樹突狀細胞(BMDCs) MHC-Ⅰ分子表面表達下降以及可以感染PR

4、RSV的猴源細胞Marc145的細胞表面MHC-Ⅰ分子的表達下降。進一步，本研究主要以高致病性的PRRSV毒株和Marc145細胞為材料，分別用針對MHC-Ⅰ-HC和β2m的單克隆抗體分析了細胞內MHC-Ⅰ和β2m的蛋白水平，結果顯示PRRSV感染能夠顯著下調Marc145中MHC-Ⅰ和β2m的蛋白表達。當使用泛素化酶E1的抑制劑PYR41抑制蛋白的泛素化降解之后，β2m的蛋白水平依然無法恢復，而且realtime qPCR結果也顯示，

5、PRRSV可以降低Marc145以及PAMs內B2M(B2M基因編碼β2m蛋白)的mRNA水平，即PRRSV可以抑制B2M的轉錄水平。
　　然后，構建表達PRRSV各個結構蛋白和非結構蛋白的真核載體，將其轉染Marc145和PK-15細胞，利用流式細胞術分析。結果表明，表達病毒非結構蛋白4(Nsp4)的真核表達載體轉染的Marc145細胞和PK-15細胞表面MHC-Ⅰ分子的表達是下降的，同時B2M的轉錄水平和蛋白水平也是降低的。<

6、br>　　接下來，通過構建包含不同轉錄調控原件的B2M啟動子調控區(qū)域序列，雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測結果表明Nsp4可以通過與B2M轉錄調控區(qū)域的調控元件結合抑制B2M的轉錄。ChIP-PCR結果也證明，Nsp4蛋白可以與B2M啟動子調控區(qū)域序列結合，調控B2M的轉錄。
　　綜上所述，本文的研究表明，PRRSV可以通過抑制B2M的轉錄水平而降低β2m的蛋白表達量，從而下調細胞表面MHC-Ⅰ分子的表達，進一步影響病毒抗原的提呈，從而