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文檔簡介
1、Dnmt1基因是DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶編碼基因的一種,該基因編碼DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1),該酶對DNA甲基化的發(fā)生以及維持有著重要作用。MeCP2基因是DNA甲基CpG結(jié)合蛋白編碼基因的一種,該基因編碼甲基CpG結(jié)合蛋白2,該蛋白是神經(jīng)細胞正常發(fā)育所必須的,并能與DNMT1蛋白相互作用共同維持DNA甲基化狀態(tài)。
本實驗室課題組在以往的魚類雜交育種研究中,利用紅鯽(RCC)作為母本,湘江野鯉鯉(CC)作為父本,進行屬間遠緣
2、雜交,成功培育出了世界上首例兩性可育的異源四倍體鯽鯉雜交品系,目前已經(jīng)形成遺傳穩(wěn)定的異源四倍體鯽鯉(4nAT)群體并成功繁殖了25代(F3-F25)。同時本實驗室課題組還利用雄性異源四倍體鯽鯉與雌性二倍體紅鯽雜交,得到了不育的異源三倍體鯽魚(3n)。該三倍體、四倍體鯽鯉的形成為我們研究不同倍性魚的分子遺傳學特征以及表觀遺傳學特征提供了寶貴的實驗材料。
在雜交與多倍體化過程中,表觀遺傳效應(yīng)對生物體的基因表達與表型特征起著重要的調(diào)
3、控作用。甲基化作為表觀遺傳調(diào)控的最主要方式,對4nAT,3n及其親本雌性RCC和雄性CC編碼甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMT1)以及甲基CpG結(jié)合蛋白2(MeCP2)的兩個基因的開放閱讀框進行序列分析,并對兩個基因在不同倍性魚的不同組織、不同胚胎發(fā)育時期以及性腺發(fā)育不同時期的進行表達研究,對探討異源四倍體鯽鯉,三倍體鯽鯉與其親本DNA甲基化差異有著重要意義。在實驗室相關(guān)研究的基礎(chǔ)上,本文對Dnmt1與MeCP2基因進行了開放閱讀框序列克隆及氨基酸
4、序列分析,同時比較分析了這兩個基因在不同倍性魚中的表達水平,為進一步從表觀遺傳學角度探討3n的不育性特征與基因表達量的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。本論文的研究結(jié)果如下:
1.對CC、RCC、3n和4nAT Dnmt1基因與MeCP2基因的開放閱讀框序列進行克隆,發(fā)現(xiàn)Dnmt1基因在RCC,3n和4nAT中都存在兩種類型:Dnmt1-α與Dnmt1-β;而CC中該基因只有一種類型;其中,RCC的Dnmt1-α與Dnmt1-β開放閱讀框長度分
5、別為4512bp和4521bp,分別編碼1503個氨基酸殘基和1506個氨基酸殘基。CCDnmt1基因其開放閱讀框長度為4512bp,共編碼了1503個氨基酸殘基。3n Dnmt1-α與Dnmt1-β開放閱讀框長度都為4527 bp,編碼1508個氨基酸殘基。4nAT Dnmt1-α與Dnmt1-β開放閱讀框長度分別為4512bp與4506 bp,各編碼1503、1501個氨基酸殘基。而MeCP2基因在CC、3n和4nAT中存在兩種類型
6、,MeCP2-α與MeCP2-β,而RCC中該基因只有一種類型;RCC該基因開放閱讀框全長為1635 bp,編碼544個氨基酸;CC的MeCP2-α與MeCP2-β開放閱讀框全長度分別為1638 bp和1623 bp,分別編碼545和540個氨基酸殘基。3n兩種類型MeCP2-α與MeCP2-β開放閱讀框序列長度分別為1623 bp和1632bp,分別編碼540和543個氨基酸殘基。4nAT的兩種類型MeCP2-α與MeCP2-β開放閱
7、讀框序列長度分別為1623 bp和1638 bp,分別編碼540和545個氨基酸殘基。通過對比分析4nAT、3n及其父母本Dnmt1基因和MeCP2基因開放閱讀框序列,發(fā)現(xiàn)兩種多倍體雜合子兩個基因編碼區(qū)都發(fā)生了插入、重組等變異。
2.采用RT-PCR的方法比較分析Dnmt1基因在四種魚不同組織中的mRNA表達情況,發(fā)現(xiàn)在四種魚的肌肉,腦,心臟,肝臟,脾臟,腎臟,卵巢和精巢組織中,都有Dnmt1基因的表達信號,但是在腦組織和性腺
8、組織中,其mRNA表達量相對較高,而在肌肉組織中mRNA表達量最低。同樣地,采用RT-PCR與Q-PCR的方法比較分析Dnmt1基因在四種魚胚胎發(fā)育各個時期的表達情況,發(fā)現(xiàn)在胚胎發(fā)育多細胞期至囊胚早期Dnmt1基因mRNA表達水平較高,隨著胚胎的繼續(xù)發(fā)育,Dnmt1基因表達水平呈顯著降低,原腸胚期后維持低水平狀態(tài)。同時,通過比較研究四種魚Dnmt1基因在繁殖期與非繁殖期性腺中的表達情況,發(fā)現(xiàn)在兩個不同時期,Dnmt1基因在卵巢中的表達均
9、比精巢中表達高,并且,在不育3n中,Dnmt1基因的表達量低于可育RCC和4nAT,而四種魚精巢中Dnmt1基因的表達沒有顯著差異,該結(jié)果表明Dnmt1基因與卵巢的發(fā)育密切相關(guān)。
3.采用RT-PCR的方法比較分析MeCP2基因在四種魚不同組織中的mRNA表達情況與Dnmt1基因表達結(jié)果相似,MeCP2基因在四種魚的肌肉,腦,心臟,肝臟,脾臟,腎臟,卵巢和精巢中均有表達,且在腦組織中的表達量最高,而性腺中表達量較高。采用RT-
10、PCR的方法以及Q-PCR,比較分析MeCP2基因在四種魚胚胎發(fā)育各個時期的表達情況,發(fā)現(xiàn)在胚胎發(fā)育時期多細胞期至囊胚早期MeCP2基因mRNA表達水平較高,到原腸胚后表達量下降,然后維持低表達水平直到出膜期。這也與Dnmt1基因在胚胎發(fā)育不同時期的結(jié)果相似。進一步的,通過比較研究四種魚性腺在繁殖期與非繁殖期MeCP2基因的表達情況,發(fā)現(xiàn)在四種魚中,MeCP2基因在繁殖期的表達都要低于非繁殖期;并且MeCP2基因在3n卵巢中的表達量水平
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