Oct-4在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化中的甲基化研究.pdf

1、目的：體外分離、培養(yǎng)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mouse Bone marrow mesenchymal stem cells，mBMSCs），并誘導(dǎo)其向成骨細(xì)胞方向分化，檢測(cè)Oct-4在mBMSCs誘導(dǎo)分化前后的表達(dá)及甲基化狀態(tài)的改變，為進(jìn)一步研究Oct-4在BMSCs增殖分化中的作用提供研究思路。 方法：采用全骨髓貼壁篩選法體外培養(yǎng)、擴(kuò)增mBMSCs。用CD29、CD44、c-Kit以及CD34免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定mBMSCs。

2、取第3代小鼠BMSCs，用含10％FBS，0.1μmol/L地塞米松，50μg/ml維生素C和10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉的高糖DMEM培養(yǎng)基定向誘導(dǎo)mBMSCs向成骨細(xì)胞分化，并用堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）染色、茜素紅染色等方法進(jìn)行鑒定，同時(shí)用體外分離培養(yǎng)的成骨細(xì)胞作陽(yáng)性對(duì)照。采用RT-PCR及間接免疫熒光染色方法，從mRNA和蛋白水平檢測(cè)Oct-4在mBMSCs成骨誘導(dǎo)分化前后的表達(dá)；運(yùn)用甲基化

3、特異PCR檢測(cè)Oct-4在mBMSCs誘導(dǎo)分化前后的甲基化狀態(tài)。 結(jié)果：mBMSCs接種24h后已大量貼壁并伸展開；48h后貼壁細(xì)胞明顯增多并分裂增殖，貼壁細(xì)胞呈梭形或成纖維細(xì)胞樣形態(tài)。傳代培養(yǎng)后，細(xì)胞形態(tài)更加均一，增殖加快，呈渦旋樣生長(zhǎng)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色和間接免疫螢光染色結(jié)果顯示第3代mBMSCs CD29、CD44、c-Kit表達(dá)陽(yáng)性，CD34表達(dá)陰性。第3代mBMSCs在成骨誘導(dǎo)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)4天后細(xì)胞形態(tài)變化，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的

4、延長(zhǎng)，細(xì)胞逐漸增大，細(xì)胞形態(tài)由長(zhǎng)梭形逐漸變?yōu)槎嘟切?。mBMSCs誘導(dǎo)10d后大多數(shù)細(xì)胞和體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞形態(tài)相似，均呈AKP和茜素紅陽(yáng)性反應(yīng)。RT-PCR結(jié)果與間接免疫熒光染色結(jié)果同時(shí)顯示，第3代的mBMSCs有Oct-4表達(dá)，而向成骨方向誘導(dǎo)10d后的mBMSCs及小鼠成骨細(xì)胞均未見Oct-4表達(dá)；MSP結(jié)果顯示，mBMSCs在向成骨方向誘導(dǎo)10天后，Oct4基因的啟動(dòng)子區(qū)的CpG島出現(xiàn)甲基化，而朱誘導(dǎo)的第3代mBMSCs為非甲基化狀