Dkk3與Wifl對(duì)擴(kuò)張型心肌病的調(diào)節(jié)制研究.pdf

1、目的:分析Dkk3與Wif1對(duì)cTnTR141W擴(kuò)張型心肌病模型小鼠的調(diào)節(jié)作用。
　　 方法:逆轉(zhuǎn)錄PCR分別檢測(cè)Dkk3與Wif1于野生型C57BL/6J小鼠中的時(shí)程表達(dá)變化,用組織原位雜交及免疫組織化學(xué)觀察Dkk3于野生型C57BL/6J小鼠中的組織表達(dá)情況。cTnTR141w及cTnTR92Q基因表達(dá)芯片及逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)Dkk3與Wif1于擴(kuò)張型心肌病及肥厚型心肌病模型小鼠中的表達(dá)變化。用逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)Dkk3與Wif

2、1于阿霉素誘導(dǎo)的心肌損傷小鼠模型中的表達(dá)變化。分別將Dkk3基因及Wif1基因插入α-MHC啟動(dòng)子下游,分別構(gòu)建轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體,通過(guò)顯微注射法建立Dkk3轉(zhuǎn)基因C57BL/6J小鼠及Wif1轉(zhuǎn)基因C57BL/6J小鼠。PCR鑒定cTnTR141W、Dkk3、Dkk3×cTnTR141W、Wif1及Wif1×cTnTR141W轉(zhuǎn)基因小鼠的基因型,Western blotting檢測(cè)Dkk3及Wif1的表達(dá),病理組織學(xué)染色和透射電鏡觀察cT

3、nTR141W、Dkk3、Dkk3×cTnTR141W、Wif1及Wifl×cTnTR141W轉(zhuǎn)基因小鼠心臟組織學(xué)及超微結(jié)構(gòu)改變。M型超聲心動(dòng)圖檢測(cè)eTnTR141W、Dkk3、Dkk3×cTnTR141W、Wif1及Wtn×cTnTR141W轉(zhuǎn)基因小鼠心臟的結(jié)構(gòu)形態(tài)和功能變化。記錄cTnTR141W、Dkk3、Dkk3×cTnTR141W、Wif1及Wif1×cTnTR141W轉(zhuǎn)基因小鼠的生存狀況。逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)cTnTR141W、

4、Dkk3、Dkk3×cTnTR141W、Wif1及Wif1×cTnTR141W轉(zhuǎn)基因小鼠心肌中包括肌小節(jié)蛋白基因、細(xì)胞骨架蛋白基因、鈣調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白基因及細(xì)胞外基質(zhì)基因等反應(yīng)心肌結(jié)構(gòu)及功能相關(guān)基因的表達(dá)變化。Western blotting檢測(cè)cTnTR141W、Dkk3、Dkk3×cTnTR141W、Wif1及Wif1×cTnTR141W轉(zhuǎn)基因小鼠心肌胞質(zhì)中β-catenin的表達(dá)。分別將cTnTR141W、Dkk3及Wif1基因插入C

5、MV啟動(dòng)子下游,分別構(gòu)建CMV-cTnTR141W、CMV-Dkk3及CMV-Wif1表達(dá)載體,脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞建立過(guò)表達(dá)cTnTR141W、Dkk3、Dkk3×cTnTR141W、Wif1及Wif1×cTnTR141W的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系,免疫熒光觀察CMV-Dkk3及CMV-Wif1穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中β-catenin的表達(dá)分布。
　　 結(jié)果:Dkk3及Wifl于野生型C57BL/6J小鼠中表達(dá)具有組織特異性,于心臟組織中皆有高表

6、達(dá)。Dkk3于野生型C57BL/6J小鼠出生前后表達(dá)最高,Wif1于胚胎期表達(dá)最高,隨著年齡增長(zhǎng)二者表達(dá)迅速下調(diào)。cTnTR141W及cTnTR92Q基因表達(dá)芯片及逆轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)果顯示,Dkk3及Wif1皆于擴(kuò)張型心肌病模型小鼠心肌中的表達(dá)有不同程度的上調(diào),且Dkk3及Wif1在肥厚型及擴(kuò)張型模型小鼠心肌中表達(dá)趨勢(shì)相反,于阿霉素誘導(dǎo)的心肌損傷模型小鼠心肌中Dkk3表達(dá)上調(diào)。分別建立了2個(gè)系的心臟組織特異的Dkk3高表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠和Wif

7、1高表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠,同時(shí)建立了心臟組織特異的Dkk3xcTnTR141W及Wif1xcTnTR141W兩種雜交小鼠。M型超聲心動(dòng)圖及心臟組織學(xué)顯示,心臟組織特異表達(dá)Dkk3轉(zhuǎn)基因小鼠心臟室壁增厚,心腔變小,心舒張功能稍有紊亂,電鏡檢測(cè)顯示心肌細(xì)胞偶見(jiàn)肥大,排列發(fā)生輕微重塑,其余結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯異常,其與輕度肥厚型心肌病病理改變相似,與cTnTR141W小鼠相比,Dkk3×cTnTR141W雜交小鼠心臟室壁增厚,心腔縮小,心收縮功能明顯改善,

8、超微結(jié)構(gòu)可見(jiàn)Dkk3xcTnTR141W雜交小鼠心肌纖維斷裂溶解現(xiàn)象明顯改善,線粒體腫脹程度明顯減輕。反應(yīng)心臟功能的肥大標(biāo)志物Nppa及Nppb的表達(dá)變化與Dkk3小鼠表型變化一致,肌小節(jié)蛋白基因Myot及Cnn1皆于Dkk3小鼠中表達(dá)下調(diào),而鈣調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白基因Atp2a2有增高趨勢(shì),反應(yīng)心肌間質(zhì)膠原成分的Col1a1及Col3a1及細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白Acta1、Itga8和Itgb1bp3皆在Dkk3xcTnTR141W小鼠中的表達(dá)增加

9、,顯示心肌細(xì)胞排列及連接發(fā)生重構(gòu)。Dkk3轉(zhuǎn)基因小鼠心肌及CMV-Dkk3穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞胞質(zhì)中β-catenin的表達(dá)顯著增加。心臟組織特異表達(dá)Wif1轉(zhuǎn)基因小鼠心臟室壁變薄,心腔增大,心收縮功能出現(xiàn)紊亂,超微結(jié)構(gòu)可見(jiàn)心肌纖維偶見(jiàn)變細(xì),肌質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張,其余結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯異常,與輕度擴(kuò)張型心肌病病理改變相似。與cTnTR141W小鼠相比,Wif1×cTnTR141W雜交小鼠心臟心腔進(jìn)一步擴(kuò)張,心收縮功能更差,超微結(jié)構(gòu)可見(jiàn)Wif1×cTnTR141

10、W雜交小鼠心肌纖維溶解、斷裂現(xiàn)象更加明顯,肌質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張并形成空泡,出現(xiàn)大量溶酶體。反應(yīng)心臟功能的肥大標(biāo)志物Nppa及Nppb的表達(dá)變化與Wif1小鼠表型變化一致,Wif1可顯著降低細(xì)胞外基質(zhì)基因Col1a1和Col3a1及細(xì)胞骨架蛋白基因Acta1及Itgb1bp3,并顯著逆轉(zhuǎn)了Col1a1、Col3a1及Acta1于cTnTR141W小鼠中的上調(diào),Wif1可顯著降低鈣調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白基因Sln,對(duì)鈣離子的轉(zhuǎn)運(yùn)有明顯的影響,Wif1可顯著降低

11、肌小節(jié)蛋白基因Myot及Cnn1,并顯著逆轉(zhuǎn)了Myot于cTnTR141W小鼠中的增高。Wif1轉(zhuǎn)基因小鼠心肌及CMV-Wif1穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞胞質(zhì)中β-catenin的表達(dá)下調(diào)。4月齡cTnTR141W轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)早期死亡,至10月齡早期死亡率達(dá)15％,Wif1×cTnTR141W小鼠死亡率高達(dá)20％,而Dkk3、Wif1及Dkk3×cTnTR141W小鼠與cTnTR141W轉(zhuǎn)基因小鼠相比較,死亡率相對(duì)較低。
　　 結(jié)論:Dkk3轉(zhuǎn)

12、基因小鼠心臟功能形態(tài)的改變與輕度肥厚型心肌病病理改變相似,同時(shí)Dkk3可明顯改善cTnTR141W小鼠擴(kuò)張型心肌病病理表型；Wif1轉(zhuǎn)基因小鼠心臟功能形態(tài)的改變與擴(kuò)張型心肌病病理改變相似,同時(shí)Wif1可進(jìn)一步加重cTnTR141W小鼠擴(kuò)張型心肌病病理表型。Dkk3與Wif1對(duì)cTnTR141W小鼠擴(kuò)張型心肌病病理表型的調(diào)節(jié)差異可能是由對(duì)β-catenin的調(diào)節(jié)差異引起的。Dkk3及Wif1很可能是心肌病調(diào)節(jié)的重要修飾基因,其可能作為心肌