雞Mx基因克隆及表達(dá)分析.pdf

1、Mx蛋白是在IFN誘導(dǎo)下產(chǎn)生的抗病毒蛋白質(zhì)，禽類的Mx蛋白具有抵抗禽流感病毒及水皰性口炎病毒(VSV)的功能，由于禽類是禽流感的自然宿主，因此對(duì)禽類Mx蛋白基因進(jìn)行研究具有重要意義。本研究以中國(guó)地方品種——北京油雞(BeiJing-You,BJY)和引進(jìn)品種——白來(lái)航(WhiteLoghom,WLH)作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，采用SSCP，RFLP分析方法研究GED區(qū)的變異，獲得Mx蛋白基因全全長(zhǎng)并對(duì)基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析；同時(shí)進(jìn)行了誘導(dǎo)條件下兩個(gè)不同

2、品種Mx蛋白基因表達(dá)差異的研究及原核表達(dá)載體的優(yōu)化及表達(dá)研究。所得結(jié)果如下： GED區(qū)是Mx蛋白執(zhí)行抗病毒的功能區(qū)域，應(yīng)用PCR-SSCP和PCR-RFLP的方法對(duì)GED區(qū)進(jìn)行研究，通過(guò)北京油雞(n=150)和白來(lái)航(n=150)兩個(gè)品種Mx基因GED區(qū)分析，發(fā)現(xiàn)在631位點(diǎn)氨基酸對(duì)應(yīng)的2216堿基突變的基因型及基因頻率在兩個(gè)品種中存在顯著差異。其中，白來(lái)航等位基因(抗病基因)A的頻率0.8471顯著高于北京油雞(0.1613)

3、；相反，北京油雞等位基因B(易感基因)的頻率(0.8387)顯著高于白來(lái)航(0.1529)。X2獨(dú)立性檢驗(yàn)表明在兩個(gè)不同的品種間，該位點(diǎn)的基因型分布存在極顯著的差異，白來(lái)航AA基因型的頻率顯著高于北京油雞。兩個(gè)群體在P2-SSCP位點(diǎn)上基因型和基因頻率都處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。 由丁對(duì)2216突變位點(diǎn)進(jìn)行PCR-RFLP研究時(shí)無(wú)合適的限制性核酸內(nèi)切酶，為方便進(jìn)行突變位點(diǎn)的檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)錯(cuò)配堿基產(chǎn)生合適的酶切位

4、點(diǎn)，建立了一套快速檢測(cè)Mx基因2216突變位點(diǎn)的檢測(cè)體系，結(jié)果穩(wěn)定可靠。 通過(guò)polyI：C誘導(dǎo)，獲得了雞Mx蛋白基因全長(zhǎng)序列，GenBank提交序列號(hào)EU348752。測(cè)序結(jié)果預(yù)測(cè)的氨基酸顯示631位是Asn，可以作為轉(zhuǎn)基因的外源DNA序列進(jìn)行轉(zhuǎn)基因研究。 利用北京油雞和白來(lái)航血液基因組DNA分別獲得了Mx基因的14個(gè)外顯子，與利用cDNA序列預(yù)測(cè)結(jié)果一致，其中編碼區(qū)包含13個(gè)外顯子，exon1為非編碼的。14個(gè)外顯子

5、大小分別為：48bp,329bp,193bp，138bp，155bp,139bp,199bp,79bp,123bp,142bp,159bp,77bp,243bp,463bp。 對(duì)北京油雞和白來(lái)航雞胚成纖維細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)的研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)不同濃度誘導(dǎo)劑(polyI：C)誘導(dǎo)時(shí)，白來(lái)航和北京油雞Mx蛋白基因表達(dá)在兩個(gè)不同的品種間存在明顯差異(半定量)，利用實(shí)時(shí)定量PCR(real-timePCR)對(duì)白來(lái)航Mx蛋白基因表達(dá)情況進(jìn)行研究，

6、獲得的結(jié)果與半定量結(jié)果相同，具體機(jī)制需要研究探討。 通過(guò)對(duì)獲得的Mx蛋白基因在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)稀有密碼子和mRNA翻譯起始區(qū)二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析，構(gòu)建了四種重組表達(dá)菌。經(jīng)優(yōu)化稀有密碼子和翻譯起始區(qū)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，在pETRTMx，pGEXRTMx重組表達(dá)菌中獲得了Mx蛋白基因的表達(dá)(75KDa)。實(shí)驗(yàn)中首次獲得了表達(dá)雞Mx蛋白基因全編碼區(qū)ORF的重組菌。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也說(shuō)明選擇合適的表達(dá)載體和宿主菌對(duì)外源基因的表達(dá)和獲得較高的表達(dá)量在原核表達(dá)選