甲基化調(diào)控的miR-130b在卵巢癌化療耐藥機(jī)制中的研究.pdf

1、卵巢癌（Ovarian cancer）是婦科腫瘤中死亡率最高的腫瘤，發(fā)病率居?jì)D女所有的惡性腫瘤的第六位。死亡率高的主要原因是卵巢癌耐藥以及臨床早期難以診斷。卵巢癌細(xì)胞易于對(duì)化療藥物如順鉑、紫杉醇等產(chǎn)生耐藥性，從而導(dǎo)致治療失敗。卵巢癌耐藥極大的影響了卵巢癌的預(yù)后，因此研究卵巢癌耐藥的發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制，繼而通過逆轉(zhuǎn)卵巢癌耐藥，能夠大大提高卵巢癌化療的效果。MicroRNAs（miRNAs）是一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA,長(zhǎng)約20~

2、25個(gè)核苷酸?？赏ㄟ^堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式識(shí)別靶mRNA，并根據(jù)互補(bǔ)程度的不同指導(dǎo)沉默復(fù)合體降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻譯。最近的研究表明miRNA 參與各種癌癥的發(fā)生發(fā)展。進(jìn)一步研究表明，卵巢癌耐藥的發(fā)生發(fā)展過程也與miRNA 有著密切的關(guān)系。因此，本研究以miRNA 130b 為研究對(duì)象，揭示其在卵巢癌耐藥中的作用。
　　 第一部分miR-130b在卵巢組織中的表達(dá)狀況的研究
　　 目的:研究miR-130b在惡

3、性，良性卵巢腫瘤組織及正常卵巢組織中的表達(dá)差異。
　　 方法:提取47例惡性，7例良性卵巢腫瘤組織及16例正常卵巢組織的RNA。用莖環(huán)實(shí)時(shí)熒光定量法檢測(cè)miR-130b在組織中的相對(duì)表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:miR-130b在正常卵巢組織，良性，惡性卵巢腫瘤組織中的表達(dá)呈下降趨勢(shì)。在FIGO分期為III～I(xiàn)V 期的患者中miR-130b的表達(dá)水平顯著低于I～I(xiàn)I 期的患者。miR-130b表達(dá)水平與年齡及病理類型無明顯相關(guān)

4、性。在低表達(dá)miR-130b的惡性病例中復(fù)發(fā)率明顯高于高表達(dá)的惡性病例。
　　 結(jié)論:miR-130b在惡性卵巢組織中低表達(dá)，與FIGO分期呈負(fù)相關(guān)，并且與卵巢癌的復(fù)發(fā)相關(guān)。因此推測(cè)miR-130b 可能與卵巢癌耐藥相關(guān)。
　　 第二部分miR-130b在卵巢癌細(xì)胞耐藥機(jī)制中的作用研究
　　 目的:研究miR-130b在卵巢癌細(xì)胞耐藥中的作用，通過上調(diào)/下調(diào)其表達(dá)，檢測(cè)對(duì)細(xì)胞耐藥性的影響。
　　 方法：用

5、莖環(huán)實(shí)時(shí)熒光定量法測(cè)定miR-130b在卵巢癌耐藥細(xì)胞株A2780/TAX,A2780/DDP 及SKOV3/TAX中的表達(dá)。通過向細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-130b模擬物mimics或者抑制物inhibitors，上調(diào)/下調(diào)miR-130b的表達(dá)，繼而用MTT 法檢測(cè)對(duì)細(xì)胞耐藥性的影響以及用細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)對(duì)細(xì)胞活性的影響。
　　 結(jié)果:miR-130b在卵巢癌耐藥細(xì)胞株A2780/TAX，A2780/DDP，SKOV3/TAX中的表達(dá)

6、較親本株A2780，SKOV3中明顯降低。通過轉(zhuǎn)染miR-130b mimics 進(jìn)入卵巢癌耐藥細(xì)胞中，細(xì)胞耐藥性明顯下降；而轉(zhuǎn)染miR-130b inhibitors 進(jìn)入卵巢癌親本株中，細(xì)胞耐藥性明顯增強(qiáng)。細(xì)胞活性結(jié)果與MTT 結(jié)果一致。
　　 結(jié)論:miR-130b在卵巢癌耐藥細(xì)胞中低表達(dá)，而增強(qiáng)其表達(dá)可以部分逆轉(zhuǎn)耐藥。
　　 第三部分miR-130b 受甲基化的調(diào)控
　　 目的:研究miR-130b的表達(dá)

7、是否受甲基化的調(diào)控，并進(jìn)一步研究去甲基化對(duì)細(xì)胞耐藥性的影響。
　　 方法:提取26例卵巢癌組織及5例卵巢良性腫瘤組織的DNA，用定量甲基化特異性PCR法檢測(cè)其甲基化水平。在細(xì)胞水平檢測(cè)耐藥細(xì)胞株和親本株的甲基化水平，并且用去甲基化藥物5-aza-CdR 處理后，檢測(cè)對(duì)miR-130b 甲基化水平，miR-130b的表達(dá)水平，以及細(xì)胞耐藥性的影響。
　　 結(jié)果:miR-130b在卵巢癌組織的中的甲基化水平顯著高于良性卵巢腫

8、瘤組織，并且miR-130b在卵巢組織中的表達(dá)水平與甲基化水平呈明顯負(fù)相關(guān)。細(xì)胞水平研究發(fā)現(xiàn)，miR-130b在耐藥細(xì)胞株中的甲基化水平明顯高于親本株。用去甲基化藥物處理后，miR-130b的甲基化水平顯著降低，表達(dá)水平顯著上升，而且可以部分逆轉(zhuǎn)細(xì)胞耐藥性。
　　 結(jié)論:miR-130b的表達(dá)受甲基化的調(diào)控，去甲基化可以部分逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞耐藥。
　　 第四部分miR-130b 靶向作用于CSF-1
　　 目的:研

9、究miR-130b 靶向調(diào)控CSF-1。
　　 方法:用實(shí)時(shí)熒光定量法檢測(cè)29例惡性，7例良性卵巢腫瘤組織及10例正常卵巢組織的CSF-1 mRNA表達(dá)水平。免疫組化檢測(cè)組織中CSF-1的表達(dá)水平。轉(zhuǎn)染miR-130bmimics或者inhibitors 進(jìn)入卵巢癌耐藥細(xì)胞后，qRT-PCR和ELISA檢測(cè)CSF-1的mRNA及蛋白表達(dá)水平。熒光素酶報(bào)告基因法檢測(cè)miR-130b與CSF-1 mRNA的3’-UTR的結(jié)合位點(diǎn)。<

10、br>　　 結(jié)果:卵巢惡性腫瘤組織中CSF-1 mRNA 水平較良性腫瘤及正常卵巢組織高。卵巢惡性腫瘤組織中CSF-1表達(dá)陽性率明顯高于良性卵巢組織。卵巢組織中CSF-1 mRNA的表達(dá)水平與miR-130b的表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)。轉(zhuǎn)染miR-130b mimics 進(jìn)入卵巢癌耐藥細(xì)胞株A2780/TAX，A2780/CP和SKOV3/TAX后，CSF-1 mRNA和蛋白水平顯著降低。而轉(zhuǎn)染了miR-130b inhibitors 進(jìn)

11、入卵巢癌親本株A2780和SKOV3后，CSF-1 蛋白的表達(dá)水平顯著升高。熒光素酶報(bào)告基因表明miR-130b可特異性的與CSF-1 mRNA的3’-UTR 結(jié)合，抑制CSF-1的表達(dá)。
　　 結(jié)論:CSF-1 為miR-130b的靶基因。
　　 第五部分miR-130b 靶向調(diào)控CSF-1在卵巢癌耐藥中的作用機(jī)制
　　 實(shí)驗(yàn)一研究CSF-1在卵巢癌耐藥中的作用
　　 目的:通過干擾CSF-1的表達(dá)，研

12、究CSF-1在卵巢癌耐藥中的作用。
　　 方法：ELISA 檢測(cè)CSF-1在卵巢癌耐藥細(xì)胞中的表達(dá)水平。合成干擾CSF-1的shRNA片段，定向克隆插入Supersilencing shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體pGPU6/GFP/Neo，獲得CSF-1shRNA表達(dá)載體。將CSF-1 shRNA 質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染卵巢癌耐藥細(xì)胞株，MTT 法檢測(cè)細(xì)胞耐藥性。
　　 結(jié)果:CSF-1在卵巢癌耐藥細(xì)胞株中的表達(dá)水平顯著高于親本株。用sh

13、RNA 干擾CSF-1的表達(dá)后，卵巢癌耐藥細(xì)胞的耐藥性明顯下降。用shRNA下調(diào)CSF-1的表達(dá)后，耐藥細(xì)胞的增殖能力明顯下降。
　　 結(jié)論:下調(diào)CSF-1的表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞耐藥。
　　 實(shí)驗(yàn)二 miR-130b 靶向調(diào)控CSF-1在卵巢癌耐藥中的作用機(jī)制
　　 目的:研究miR-130b 通過靶向調(diào)控CSF-1 對(duì)卵巢癌細(xì)胞的耐藥性的影響。
　　 方法:通過向親本株中同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-130b in