阿司匹林誘生型脂氧素A4對(duì)脂多糖誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響.pdf

1、第一部分阿司匹林誘生型脂氧素A4 對(duì)脂多糖誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥介質(zhì)表達(dá)的影響
　　 目的：研究阿司匹林誘生型脂氧素A4(ATL)對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生及其Mrna的表達(dá)的影響，以探討ATL 對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響及其機(jī)制。
　　 方法：以100ng/ml的LPS 刺激體外培養(yǎng)的BV-2細(xì)胞作為炎癥模型，根據(jù)藥物不同將細(xì)胞分為5組：⑴對(duì)照組：用含0.035％乙醇的無血清培養(yǎng)基處理；⑵ATL組：用

2、含不同濃度ATL（1nM、10nM、100nM）的無血清培養(yǎng)基處理；⑶LPS組：用含0.035％乙醇的無血清培養(yǎng)基處理30min后加終濃度為100ng/ml的LPS處理；⑷ATL+LPS組：用含不同濃度ATL（1nM、10nM、100nM）的無血清培養(yǎng)基處理30min后加終濃度為100ng/ml的LPS 處理。⑸Boc-2+ATL+LPS組：在用ATL和LPS 處理前加100μM Boc-2 處理30min。逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測BV-2細(xì)胞

3、脂氧素A4 受體（ALX）基因水平的表達(dá)；采用MTT 法測定各組細(xì)胞活力；ELISA 法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中白介素-1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的濃度；硝酸還原酶法測定細(xì)胞培養(yǎng)上清中一氧化氮（NO）的濃度；Western blotting檢測細(xì)胞誘導(dǎo)性一氧化氮合酶（Inos）蛋白表達(dá)；real-time PCR檢測細(xì)胞Inos、IL-1β和TNF-αMrna的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞在Mr

4、na水平表達(dá)ALX（ALX1/FPR-rs1和ALX2/FPR2），LPS 刺激6h 可上調(diào)其表達(dá)。不同濃度的ATL 對(duì)LPS 刺激24h的BV-2細(xì)胞活力無顯著的影響。100ng/ml LPS 刺激BV-2細(xì)胞24h，細(xì)胞培養(yǎng)上清中的NO、IL-1β和TNF-α水平均顯著升高。10nM和100nM ATL能夠抑制LPS 誘導(dǎo)的NO、IL-1β和TNF-α產(chǎn)生；1nM ATL 對(duì)炎癥相關(guān)介質(zhì)的產(chǎn)生無明顯影響。ALX 拮抗劑Boc-2 能

5、顯著阻斷ATL的抗炎效應(yīng)。與對(duì)照組相比，100ng/ml LPS 刺激BV-2細(xì)胞6h，Inos、IL-1β和TNF-αmRNA的表達(dá)水平均顯著升高。與LPS組相比，10nM和100nMATL 能降低LPS 誘發(fā)的Inos、IL-1β和TNF-αMrna的表達(dá)水平上調(diào)。
　　 結(jié)論：ATL 可抑制LPS 誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥介質(zhì)NO、IL-1β和TNF-α的產(chǎn)生。ATL的抗炎作用可能是通過抑制炎癥介質(zhì)的基因表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。

6、　　 第二部分阿司匹林誘生型脂氧素A4 對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞脂多糖/Toll 樣受體4 介導(dǎo)的信號(hào)通路的影響
　　 目的：研究ATL 對(duì)LPS/Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4）誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞核因子Κb（NF-Κb）和絲裂原激活蛋白激酶（MAPKs）信號(hào)通路激活的影響，以探討ATL在小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮抗炎作用的機(jī)制。
　　 方法：以100ng/ml的LPS 刺激體外培養(yǎng)的BV-2細(xì)胞作為炎癥模型，根據(jù)

7、藥物不同將細(xì)胞分為4組：⑴對(duì)照組：用含0.035％乙醇的無血清培養(yǎng)基處理；⑵ATL組：用含100nM ATL的無血清培養(yǎng)基處理；⑶LPS組：用含0.035％乙醇的無血清培養(yǎng)基處理30min后加終濃度為100ng/ml的LPS 處理；⑷ATL+LPS組：用100nM ATL的無血清培養(yǎng)基處理30min后加終濃度為100ng/ml的LPS 處理。激光共聚焦顯微鏡觀察NF-Κb p65亞基在細(xì)胞內(nèi)定位的變化；Western blotting

8、檢測細(xì)胞p65亞基的轉(zhuǎn)位、IκB-α蛋白降解以及MAPKs 蛋白磷酸化；電泳遷移率分析（EMSA）檢測轉(zhuǎn)錄因子NF-Κb和激活蛋白-1（AP-1）的DNA結(jié)合活性。
　　 結(jié)果：100ng/ml LPS 刺激BV-2細(xì)胞可誘導(dǎo)NF-Κb p65亞基核轉(zhuǎn)位，作用60min時(shí)核轉(zhuǎn)位最顯著；免疫熒光和Western blotting 結(jié)果均顯示，100nM ATL 預(yù)處理可抑制LPS 誘導(dǎo)的p65核轉(zhuǎn)位。此外，100nM ATL 可抑

9、制LPS 誘導(dǎo)的IκB-α蛋白降解。LPS 可誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞的細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）1/2、p38、c-Jun 氨基末端激酶（JNK）磷酸化水平增加，作用30min 時(shí)磷酸化最顯著；100nM ATL 可抑制LPS誘導(dǎo)的ERK1/2、p38 磷酸化，對(duì)JNK 磷酸化無顯著影響；100nM ATL 可誘導(dǎo)JNK磷酸化水平增加。EMSA 結(jié)果顯示，100nM ATL 可抑制LPS 誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子NF-Κb和AP-1的DNA結(jié)合活性增加

10、。
　　 結(jié)論：ATL 可抑制LPS 誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞IκB 降解、抑制NF-Κb 核轉(zhuǎn)位以及ERK1/2、p38 磷酸化、抑制NF-Κb和AP-1的轉(zhuǎn)錄活性。因此，ATL 發(fā)揮抗炎作用可能是通過抑制NF-Κb和MAPK/AP-1 信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。
　　 第三部分阿司匹林誘生型脂氧素A4 對(duì)脂多糖誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響
　　 目的：研究ATL 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活性氧簇（ROS）產(chǎn)生的影響，探討AT

11、L在小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮抗氧化的機(jī)制。
　　 方法：以100ng/ml的LPS 刺激體外培養(yǎng)的BV-2細(xì)胞作為炎癥模型，根據(jù)藥物不同將細(xì)胞分為4組：⑴對(duì)照組：用含0.035％乙醇的無血清培養(yǎng)基處理；⑵ATL組：用含100nM ATL的無血清培養(yǎng)基處理；⑶LPS組：用含0.035％乙醇的無血清培養(yǎng)基處理30min后加終濃度為100ng/ml的LPS 處理；⑷ATL+LPS組：用100nM ATL的無血清培養(yǎng)基處理30min后加終濃度為1

12、00ng/ml的LPS 處理。采用熒光探針DCFH-DA 檢測細(xì)胞內(nèi)ROS的水平；激光共聚焦顯微鏡檢測血紅素加氧酶-1（HO-1）的表達(dá)；Western blotting 檢測細(xì)胞HO-1的表達(dá)、核因子紅系-2p45相關(guān)因子2（Nrf2）的表達(dá)及其核轉(zhuǎn)位。
　　 結(jié)果：100ng/ml LPS 誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞ROS 水平增高，12h 達(dá)到峰值；100nM ATL預(yù)處理30min 可顯著減少ROS 產(chǎn)生。ATL 可時(shí)間依賴性、劑

13、量依賴性地上調(diào)HO-1 蛋白表達(dá)，100nM ATL 作用24h 達(dá)到峰值。免疫熒光結(jié)果表明，100nM ATL處理細(xì)胞24h后，HO-1 熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。Western blotting 結(jié)果顯示，100nM ATL處理細(xì)胞可時(shí)間依賴性地上調(diào)Nrf2 蛋白表達(dá)；此外，ATL在短時(shí)間(120min)內(nèi)即可誘導(dǎo)Nrf2 蛋白核轉(zhuǎn)位并增強(qiáng)LPS 誘導(dǎo)的Nrf2 核轉(zhuǎn)位。
　　 結(jié)論：ATL 能夠抑制LPS 誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞ROS