PRRSV遺傳變異分析及其nsp2蛋白的定量相互作用組學研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)主要以妊娠母豬發(fā)生明顯的繁殖障礙以及仔豬出現(xiàn)嚴重的呼吸系統(tǒng)疾病和生長遲緩為主要特征，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起一種嚴重危害全球養(yǎng)豬業(yè)的病毒性傳染病。尤其是2006年由高致病性PRRSV(HP-PRRSV)引發(fā)的豬“高熱病”給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了沉重的打擊。之后，2009年、2011年和2015年PRRS在我國都出現(xiàn)不同程度的暴發(fā)。此外，2015年來自美國的NADC30-like毒株在我國不同省

2、份引發(fā)母豬嚴重的流產或早產。因此，非常有必要對我國PRRSV流行病學、基因變異和同源重組等情況進行跟蹤調查，并掌握PRRSV的遺傳變異規(guī)律，為PRRSV的防控提供理論基礎。
　　PRRSV nsp2蛋白作為PRRSV最大的非結構蛋白，也是PRRSV基因組中突變率最高的蛋白之一，可以通過對nsp2基因的監(jiān)控，以達到了解PRRSV的遺傳演化和變異規(guī)律的目的，更重要的是，nsp2能夠在病毒復制和免疫調控方面都發(fā)揮著非常重要的作用，因此，

3、本研究利用定量相互作用組學的方法對與nsp2相互作用的其他病毒蛋白和宿主蛋白進行LC-MS/MS鑒定。主要研究內容包括:
　　1.PRRSV流行病學調查及新毒株的分離鑒定
　　2010年至2015年間在我國東南17省收集了1909份臨床樣品，對其進行流行病學調查，其中PRRSV經(jīng)典株的陽性率僅為3.87％，而HP-PRRSV毒株的陽性率高達43.48％，且呈逐年下降趨勢。發(fā)現(xiàn)我國PRRSV的流行趨勢逐漸從以HP-PRRSV毒

4、株的流行為主，變?yōu)橐訬ADC30-like毒株的流行為主，并且有兩種毒株共感染的情況存在。同時發(fā)現(xiàn)豬的糞便樣品中也能檢測到PRRSV，陽性率可達43.97％，并從中分離到一株HP-PRRSV: WUH4株，推測PRRSV可以通過糞-口途徑傳播這一新方式。此外，2014年以后在臨床上檢測到了PRRSV NADC30-like毒株的流行，陽性率高達63.04％。在PRRSV NADC30-like陽性樣品中，成功地分離到PRRSVWUH5和

5、WUH6兩株毒株。全基因組及各個蛋白序列比對分析，發(fā)現(xiàn)WUH5和WUH6株在nsp2的HV區(qū)域都存在130個氨基酸的不連續(xù)缺失。通過同源重組進一步分析，發(fā)現(xiàn)WUH6株為重組毒株，并推測其親本可能為NADC30和JXA1株，其中間重組區(qū)域與JXA1毒株高度同源，而兩端區(qū)域與NADC30毒株有較高的相似度。
　　2.PRRSV nsp2定量相互作用組學研究
　　利用SILAC結合IP實驗的定量相互作用組學技術，在PRRSV感染的

6、條件下對與nsp2蛋白相互作用的蛋白進行串聯(lián)質譜(LC-MS/MS)分析，鑒定出9個病毒蛋白和62個宿主蛋白能夠與nsp2發(fā)生特異性互作，并利用IPA軟件對與nsp2互作的62個宿主蛋白進行相互作用網(wǎng)絡分析，進而生成了nsp2互作網(wǎng)絡圖。
　　在PRRSV感染和超表達條件下對病毒蛋白與nsp2之間的相互作用進行了驗證，實驗證實nsp2能夠與nsp1α、nsp1β和N發(fā)生相互作用，而nsp2與GP5只在病毒感染條件下有間接的相互作用

7、。同時，在PRRSV感染和超表達條件下對宿主蛋白與nsp2之間的相互作用進行了驗證，實驗證實nsp2能夠與YWHAB、YWHAZ和MARK2分別發(fā)生相互作用，而nsp2與vimentin只在病毒感染條件下有間接的相互作用。但是，有趣的是，通過實驗Co-IP實驗證實了作為PRRSV受體之一的vimentin能夠與nsp2和N蛋白能夠形成一個蛋白復合體，其中N蛋白起著橋梁的作用。在N蛋白的存在下，nsp2與vimentin蛋白能夠相互地發(fā)生