抗人CD45亞類新單抗ZCH-6-3A4識別抗原表位的研究.pdf_第1頁
已閱讀1頁,還剩147頁未讀, 繼續(xù)免費閱讀

下載本文檔

版權說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權,請進行舉報或認領

文檔簡介

1、目的:
   急性白血病是兒童時期發(fā)病率最高的惡性腫瘤,我國每年至少有15000個新發(fā)病例。其中急性淋巴細胞性白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)約占70%,急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)約占25%。在兒童和青年的惡性腫瘤中白血病死亡率居首位。近年來聯(lián)合化療明顯改善了兒童ALL的預后,但仍有20%~30%的高?;純喝狈τ行Ц深A手段,而AML治療效果更遜

2、色于ALL。治療失敗的原因,主要是常規(guī)化療選擇性差,毒副作用大,還有白血病細胞的化療耐藥及復發(fā)等問題。因此,有必要尋找選擇性高,毒副作用小的治療方法來進一步提高白血病患兒生存率和生存質(zhì)量,而靶向治療可能是解決這一問題的重要途徑和目前的研究熱點。Rituximab(人鼠嵌合型抗人CD20單抗,美羅華)是靶向治療成功的典范,實驗研究和臨床應用證明該單抗在CD20+B細胞惡性淋巴瘤治療中具有良好療效。
   CD45是位于細胞表面的白

3、細胞共同抗原(leukocyte common antigen,LCA),穩(wěn)定并高水平地表達在除紅系細胞、巨核細胞系/血小板、正常的原始造血干細胞之外的所有造血細胞表面,并且在85%~90%的白血病細胞表面也表達,而在機體其它非造血器官組織細胞不表達,這種差異表達使其具有了良好的靶向性??笴D45單抗的研制為白血病的靶向治療提供了新的手段。
   CD45編碼基因外顯子4、5、6或稱A、B、C的可選擇性剪接產(chǎn)生了多種變異體,在人

4、體細胞上,CD45RO、CD45RB、CD45RAB、CD45RBC、CD45RABC這5種變異體已在蛋白水平被檢測到,相對分子質(zhì)量范圍在180~220 kDa,CD45RAB和CD45RABC統(tǒng)稱為CD45RA。
   本實驗室自行研制的具有自主知識產(chǎn)權的雜交瘤細胞系分泌的鼠抗人單克隆抗體ZCH-6-3A4(簡稱3A4)已經(jīng)通過國際鑒定為抗人CD45亞類抗體,屬鼠IgG1κ,2000年被第7屆國際人類白細胞分化抗原協(xié)作組會議(

5、簡稱HLDA7)正式命名為CD45RA。本實驗室研究表明,3A4單抗不能阻滯CD45抗體(克隆名2D1,IgG1,識別180~220 kDa所有人CD45蛋白亞型)與KG1a細胞的反應,這表明3A4單抗與CD45抗體識別的表位不同。3A4單抗也不能阻滯CD45RO抗體(克隆名UCHL-1,識別180kDa的人CD45蛋白亞型CD45RO)與CD45RO陽性的T細胞反應,這表明3A4單抗不能識別CD45RO。3A4單抗能夠阻滯CD45RA

6、單抗(克隆名L48,識別220kDa的人CD45蛋白亞型CD45RABC)與KG1a細胞的反應。一般來說,3A4既然能夠阻滯另一個標準CD45RA抗體與KG1a細胞的反應,那么它應該識別與之相同的抗原表位,并且應該具有類似的細胞反應譜。但我們進一步研究發(fā)現(xiàn)3A4單抗與白血病細胞的反應譜與CD45RA(L48)尚存在比較明顯的差別。因此,有必要澄清3A4單抗所識別抗原表位,為此單抗的進一步深入研究及其應用奠定基礎。
   方法:<

7、br>   (1)制備3A4 FITC直標抗體。
   將3A4雜交瘤細胞系注入Balb/c小鼠腹腔內(nèi)制備含3A4抗體的腹水,采用SPA Sepharose親和層析法從腹水中純化3A4抗體蛋白。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)鑒定抗體純度及分子量,采用改良Marshall法制備異硫氰酸熒光素標記的3A4抗體(3A4 FITC),并通過流式細胞術(flwo cytometry,FCM)鑒定。
   (2)建立

8、3A4識別的抗原表達譜。
   由于CD45編碼序列的外顯子4、5、6的可選擇性剪接而產(chǎn)生各種蛋白亞型,因此設計引物擴增CD45序列的外顯子2至外顯子8的部分序列(我們命名為CD45-1),PCR檢測各種細胞在基因水平的CD45亞型分布情況。通過流式細胞術檢測3A4識別的抗原在人正常外周血、PHA活化的外周血T淋巴細胞、白血病細胞以及細胞系上的分布。并通過Western Blot檢測白血病細胞系上3A4抗原的分布。
  

9、 (3)真核表達載體pcDNA3.1+/CD45RBC的構建。
   根據(jù)美國國家生物技術信息中心(NCBI)上檢索到的CD45基因序列(NM002838)設計引物擴增自起始密碼子至終止密碼子的CD45基因序列全長。由于外顯子4、5、6的可選擇性剪接導致有多個變異體同時存在,導致無法用單次PCR得到單個變異體,故把CD45基因人為的分割成4個部分(我們命名為CD45-1、CD45-2、CD45-3和CD45-4),CD45-1與

10、CD45-2、CD45-2與CD45-3、CD45-3與CD45-4均有一小段重疊序列。設計4對引物分別擴增CD45-1(2-8號外顯子)、CD45-2(8-15號外顯子,1038bp)、CD45-3(15-24號外顯子,963bp)和CD45-4(24-33號外顯子,1343bp),其中CD45-1序列上游引物5’端引入Hindm酶切位點,CD45-4序列下游引物5’端引入XhoⅠ酶切位點。然后采用重疊延伸拚接PCR(splicing

11、 by ovedap extension PCR,SOE-PCR)將CD45-1、CD45-2、CD45-3和CD45-4這4個片段在基因水平上拚接擴增,克隆得到CD45基因全長的cDNA。并通過TA克隆系統(tǒng)將其克隆到pCR(R)-2.1載體中,經(jīng)測序鑒定,我們首先成功克隆得到的是序列完全匹配的pCR(R)-2.1/CD45RBC的TA克隆。因此我們首先構建CD45RBC的真核表達載體。將pCR(R)-2.1/CD45RBC和真核表達載

12、體pcDNA3.1+用HindⅢ和XhoⅠ雙酶切后連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5α,挑取克隆搖菌擴增后抽提質(zhì)粒DNA經(jīng)酶切及測序鑒定為目的基因,至此得到真核表達載體pcDNA3.1+/CD45RBC。
   (4)真核表達載體pcDNA3.1+/CD45RA、pcDNA3.1+/CD45RAB和pcDNA3.1+/CD45RABC的構建。
   CD45-1片段包括外顯子2至外顯子8的部分序列(外顯子4、5、6為可選

13、擇性剪接序列),因此而產(chǎn)生的變異體我們分別命名為CD45RO-1、CD45RA-1、CD45RB-1、CD45RC-1、CD45RBC-1、CD45RAB-1和CD45RABC-1,分別構建相應的TA克隆。各亞型均有一段99bp的共同序列(包括7號外顯子和8號外顯子部分堿基),其中有AfeⅠ的酶切位點.將TA克隆pCR(R)-2.1/CD45RA-1、pCR(R)-2.1/CD45RAB-1、pCR(R)-2.1/CD45RABC-1和

14、pcDNA3.1+/CD45RBC分別用HindⅢ和AfeⅠ雙酶切后連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5α,挑取克隆搖菌擴增后抽提質(zhì)粒DNA經(jīng)酶切及測序鑒定為目的基因,至此分別得到真核表達載體pcDNA3.1+/CD45RA、pcDNA3.1+/CD45RAB和pcDNA3.1+/CD45RABC。
   (5)CD45抗原亞型在真核細胞膜上的表達及3A4抗體識別抗原的鑒定。
   將空載體pcDNA3.1+以及構建成功的

15、真核表達載體pcDNA3.1+/CD45RA、pcDNA3.1+/CD45RBC、pcDNA3.1+/CD45RAB和pcDNA3.1+/CD45RABC分別搖菌擴增,轉(zhuǎn)染級抽提試劑盒抽提質(zhì)粒,紫外分光光度計和電泳測質(zhì)粒DNA濃度和純度。然后采用LipofectamineTM2000試劑盒通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將空載體pcDNA3.1+和上述4個CD45基因亞型真核表達載體分別轉(zhuǎn)染入真核細胞CHO,通過G418篩選并通過多次亞克隆建立穩(wěn)定

16、轉(zhuǎn)染細胞系。抽提轉(zhuǎn)染后細胞總RNA,通過RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后細胞內(nèi)基因的表達情況。采用流式細胞術檢測轉(zhuǎn)染后細胞膜上的CD45蛋白表達情況。通過流式細胞術及Western blot等方法鑒定3A4抗體所識別的抗原亞型。
   (6)CD45斷裂基因(CD45-B17)真核表達載體的構建。
   由于CD45基因亞型真核表達載體較大,轉(zhuǎn)染后CHO穩(wěn)定轉(zhuǎn)染建系較困難。為了提高轉(zhuǎn)染效率,建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CD45基因的細胞系,并進一

17、步鑒定3A4抗體識別的抗原表位,我們又構建了5個CD45斷裂基因真核表達載體pcDNA3.1+/CD45RA—B17、pcDNA3.1+/CD45RC—B17、pcDNA3.1+/CD45RBC-B17、pcDNA3.1+/CD45RAB—B17和pcDNA3.1+/CD45RABC-B17。
   CD45基因的16號外顯子序列是編碼跨膜區(qū)的,在17號外顯子中插入一個終止密碼子TAG,構建從CD45的起始密碼子至17號外顯子(

18、包括跨膜區(qū)編碼序列)的真核表達載體,使CD45蛋白翻譯提前終止,形成只包括胞外區(qū)和跨膜區(qū)的斷裂蛋白。CD45基因序列僅在10號外顯子中存在一個BsrGⅠ的酶切位點,我們利用PCR在17號外顯子中引入一個終止密碼子TAG和XhoⅠ酶切位點,構建自BsrGⅠ酶切位點至XhoⅠ酶切位點的TA克隆(pCR(R)-2.1/B17),然后將pCR(R)-2.1/B17和pcDNA3.1+/CD45RA、pcDNA3.1+/CD45RBC、pcDNA

19、3.1+/CD45RAB、pcDNA3.1+/CD45RABC利用BsrGⅠ和XhoⅠ雙酶切后連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH50α,挑取克隆搖菌擴增后抽提質(zhì)粒DNA經(jīng)酶切及測序鑒定為目的基因,至此分別得到真核表達載體pcDNA3.1+/CD45RA-B17、pcDNA3.1+/CD45RBC—B17、pcDNA3.1+/CD45RAB-B17和pcDNA3.1+/CD45RABC-B17。
   將pCR(R)-2.1/CD4

20、5RC-1和pcDNA3.1+/CD45RBC-B17用HindⅢ和AfeⅠ雙酶切后連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5α,挑取克隆搖菌擴增后抽提質(zhì)粒DNA經(jīng)酶切及測序鑒定為目的基因,至此得到真核表達載體pcDNA3.1+/CD45RC-B17。
   (7)CD45斷裂蛋白亞型在真核細胞膜上的表達及3A4抗體識別抗原的進一步鑒定。
   將空載體pcDNA3.1+以及構建成功的真核表達載體pcDNA3.1+/CD45RA

21、-B17、pcDNA3.1+/CD45RC-B17、pcDNA3.1+/CD45RBC-B17、pcDNA3.1+/CD45RAB-B17和pcDNA3.1+/CD45RABC-B17分別搖菌擴增,轉(zhuǎn)染級抽提試劑盒抽提質(zhì)粒,紫外分光光度計和電泳測質(zhì)粒DNA濃度和純度。然后采用LipofectamineTM2000試劑盒通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將空載體pcDNA3.1+和上述5個CD45斷裂基因亞型真核表達載體分別轉(zhuǎn)染入真核細胞CHO,通過G

22、418篩選并通過多次亞克隆建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系。抽提轉(zhuǎn)染后細胞總RNA,通過RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后細胞內(nèi)基因的表達情況。采用流式細胞術檢測轉(zhuǎn)染后細胞膜上的CD45斷裂蛋白表達情況。通過流式細胞術及Western blot等方法鑒定3A4抗體所識別的抗原亞型。
   結果:
   (1)經(jīng)過SDS-PAGE鑒定,3A4重鏈和輕鏈分子量分別為58kDa和30kDa。流式細胞術檢測結果顯示,制備的3A4 FITC直標抗體與KG1

23、a細胞陽性反應率超過98%,表達峰型狹窄。
   (2)3A4識別的抗原在人正常外周血的T細胞、B細胞和NK細胞表面高表達(78.16±8.77%、99.31±1.01%、88.58±10.81%),單核細胞表面部分表達(39.39±12.28%),而中性粒細胞表面不表達(2.07±0.35%)。對PHA活化的外周血T淋巴細胞進行流式細胞術分析發(fā)現(xiàn),隨著活化時間的延長,3A4識別的抗原表達減少。對30例(B系ALL14例,T系A

24、LL5例,.AML11例)初診白血病患者骨髓中的白血病細胞進行流式細胞術分析后發(fā)現(xiàn),進口CD45RA的陽性率低于3A4。
   (3)流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)3A4識別的抗原在KG1a、Raji和U937細胞上均為高表達,Molt-3細胞上低表達,而Nalm-6、K562和HL60細胞不表達。分別以細胞系U937、KG1a、Raji、Molt-3、Nalm-6、K562和HL60 cDNA為模板,以CD45-1上下游引物擴增CD45序

25、列的外顯子2至外顯子8的部分序列(CD45-1)。PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳、切膠純化、TA克隆并經(jīng)測序鑒定結果表明,這7種細胞系均有多個CD45-1基因亞型。U937和KG1a表達CD45RABC-1和CD45RBC-1,Raji表達CD45RABC-1、CD45RBC-1和CD45RB-1(微量),Nalm-6表達微量的CD45RABC-1、CD45RBC-1、CD45RB-1和CD45RO-1,Molt-3表達CD45RAB-1

26、、CD45RBC-1、CD45RB-1和CD45RO-1,K562和HL60(微量)表達CD45RB-1和CD45RO-1。Western Blot結果表明,3A4抗體識別的抗原大小為200kDa左右,Raji和KG1a細胞裂解液中均有豐富的3A4抗體識別的抗原,而K562和Nalm-6細胞裂解液中未檢測到3A4抗體識別的抗原。
   (4)真核表達載體pcDNA3.1+/CD45RA、pcDNA3.1+/CD45RBC、pcD

27、NA3.1+/CD45RAB和pcDNA3.1+/CD45RABC擴增提取質(zhì)粒DNA后經(jīng)酶切及測序鑒定分別包含相應的目的基因片段CD45RA(3714bp)、CD45RBC(3801bp)、CD45RAB(3855bp)和CD45RABC(3999bp),表明該4個CD45基因真核表達載體已構建成功。
   (5)構建成功的4個CD45基因真核表達載體和空載體分別轉(zhuǎn)染真核細胞CHO,然后按照測定的CHO細胞對G418的死亡曲線,

28、以600μg/ml的G418篩選濃度進行持續(xù)加壓篩選。轉(zhuǎn)染后細胞分別命名為CD45RA-CHO、CD45RBC-CHO、CD45RAB-CHO和CD45RABC-CHO。2-3周后進行目的基因及蛋白表達檢測。RT-PCR結果顯示轉(zhuǎn)染后的各亞型CD45-CHO細胞中CD45-1基因大小均與理論序列相符合,表明目的基因在基因水平有表達。通過流式細胞術在蛋白水平檢測到CD45抗原在CD45-CHO細胞膜上成功表達。
   (6)流式細

29、胞術結果顯示3A4能夠識別CD45RBC-CHO和CD45RABC-CHO細胞上的抗原。Western Blot顯示3A4識別CD45RBC-CHO和CD45RABC-CHO細胞裂解液中200kDa左右的蛋白質(zhì),而CD45RA-CHO和CD45RAB-CHO細胞上未檢測到3A4抗體識別的抗原。
   (7)由于CD45基因亞型真核表達載體較大(近10000bp),轉(zhuǎn)染后CHO穩(wěn)定轉(zhuǎn)染建系較困難。傳代第5~6次以后陽性細胞數(shù)便低于

30、10%。尚未能建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系。為了提高轉(zhuǎn)染效率,建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CD45基因的細胞系,并進一步鑒定3A4抗體識別的抗原表位,我們又構建了5個CD45斷裂基因真核表達載體pcDNA3.1+/CD45RA—B17、pcDNA3.1+/CD45RC-B17、pcDNA3.1+/CD45RBC—B17、pcDNA3.1+/CD45RAB-B17和pcDNA3.1+/CD45RABC-B17。這5個表達載體擴增提取質(zhì)粒DNA后經(jīng)酶切及測序鑒定分別

31、包含相應的目的基因片段CD45RA-B17(1583bp)、CD45RC-B17(1529bp)、CD45RBC-B17(1670bp)、CD45RAB-B17(1724bp)和CD45RABC-B17(1868bp),表明這5個CD45斷裂基因真核表達載體已構建成功。
   (8)構建成功的5個CD45斷裂基因真核表達載體和空載體分別轉(zhuǎn)染真核細胞CHO,然后以600μg/ml的G418篩選濃度進行持續(xù)加壓篩選。轉(zhuǎn)染后細胞分別命

32、名為CD45RA-B17-CHO、CD45RC-B17-CHO、CD45RBC-B17-CHO、CD45RAB-B17-CHO和CD45RABC—B17-CHO。2-3周后進行目的基因及蛋白表達檢測。RT-PCR結果顯示轉(zhuǎn)染后的各亞型CD45-B17-CHO細胞中CD45斷裂基因大小均與理論序列相符合,表明目的基因在基因水平有表達。通過流式細胞術在蛋白水平檢測到CD45斷裂蛋白在CD45-B17-CHO細胞膜上成功表達。
  

33、(9)流式細胞術和細胞免疫熒光顯示3A4能夠識別CD45RC-B17-CHO、CD45RBC-B17-CHO和CD45RABC-B17-CHO細胞上的抗原。Western Blot結果3A4識別CD45RC-B17-CHO、CD45RBC-B17-CHO和CD45RABC-B17-CHO細胞裂解液中70kDa左右的蛋白質(zhì),而CD45RA-B17-CHO和CD45RAB—B17-CHO細胞上未檢測到3A4抗體識別的抗原。
   (

34、10)通過G418篩選建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系,其中CD45RBC-B17-CHO和CD45RC-B17-CHO建系成功。
   結論:
   (1)3A4識別的抗原主要分布在T細胞、B細胞、NK細胞、單核細胞膜,而中性粒細胞膜上不表達。
   (2)成功構建pcDNA3.1+/CD45RA、pcDNA3.1+/CD45RAB、pcDNA3.1+/CD45RBC和pcDNA3.1+/CD45RABC及pcDNA3.1+

35、/CD45RA—B17、pcDNA3.1+/CD45RC-B17、pcDNA3.1+/CD45RAB—B17、pcDNA3.1+/CD45RBC-B17和pcDNA3.1+/CD45RABC-B17真核表達載體。在基因水平和蛋白水平檢測到轉(zhuǎn)染CHO細胞成功,CD45均能在CHO細胞膜上成功表達。其中CD45RBC-B17-CHO和CD45RC-B17-CHO獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系。
   (3)3A4能夠識別轉(zhuǎn)染CD45基因的細胞C

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負責。
  • 6. 下載文件中如有侵權或不適當內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

評論

0/150

提交評論