納米金標(biāo)記—逐步銀染法快速檢測(cè)金黃色葡萄球菌.pdf

1、目的:建立一種可以在微孔板上快速檢測(cè)金黃色葡萄球菌的納米金標(biāo)記-逐步銀染法，并將該方法應(yīng)用于多種臨床標(biāo)本的快速檢測(cè)。
　　 方法:采用HEPES還原法制備納米金，并使其與巰基修飾的寡核苷酸探針偶聯(lián)從而制備納米金探針。以金黃色葡萄球菌特異的nuc基因?yàn)榘行蛄校眉喊绘溍褂H和素的微孔板，將PCR擴(kuò)增的nuc基因與生物素探針、納米金探針形成的三明治雜交結(jié)構(gòu)錨定其上，加入銀染液于低溫下逐步銀染顯色，通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)放大的銀染信號(hào)。評(píng)價(jià)

2、該方法的靈敏度、特異性及重復(fù)性。對(duì)51例臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，并將檢測(cè)結(jié)果與PCR法、培養(yǎng)生化鑒定法進(jìn)行比較。
　　 結(jié)果:制備出平均粒徑為12 nm，且高度分散的納米金溶液。標(biāo)記了巰基探針的納米金的最大吸收峰發(fā)生了5 nm紅移。通過(guò)一系列優(yōu)化實(shí)驗(yàn)建立微孔板上納米金標(biāo)記-逐步銀染檢測(cè)體系:逐步銀染的條件為4℃銀染，5 min×4次;雜交體系中生物素探針的最適濃度為100 nmol/L;納米金探針最適濃度為20 nmol/L。該方法可

3、以在顯著降低非特異性背景信號(hào)的同時(shí)放大銀染信號(hào)，檢測(cè)金黃色葡萄球菌nuc基因的靈敏度為1 pmol/L，比常溫一步銀染法的靈敏度提高約102倍。與所試驗(yàn)的其他菌株均無(wú)非特異性擴(kuò)增與雜交。600 pmol/L和6 nmol/L靶序列的批內(nèi)、批間變異系數(shù)均小于10％。51例臨床標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果與PCR法一致，與培養(yǎng)生化鑒定法的檢測(cè)結(jié)果之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。
　　 結(jié)論:本研究成功構(gòu)建了金黃色葡萄球菌的納米金標(biāo)記-逐步銀染法