遺傳性凝血因子V缺乏癥分子病理機(jī)制的研究和2A型vWD的臨床研究.pdf

1、該課題在對具有先天性出血傾向的門診患者進(jìn)行篩查的過程中,發(fā)現(xiàn)了一例重型凝血因子V缺乏癥患者.隨后,采用比濁法、凝血因子活性測定、BA-ELISA法、Western blot、PCR及其相關(guān)技術(shù)等生物化學(xué)、免疫學(xué)及分子生物學(xué)等多種方法,對先證者及其家系進(jìn)行了研究.該研究中,家系成員FV:Ag的BA-ELISA法測定結(jié)果與FV活性測定有良好的相關(guān)性,先證者FV活性與抗原均呈嚴(yán)重缺乏,分別為1％和1.54％.家系成員中雜合子的FV抗原也呈現(xiàn)與

2、活性相平行的減低.采用基因擴(kuò)增、T/A克隆及DNA序列測定的方法對先證者FV基因組DNA25個外顯子及其5'端非翻譯區(qū)全部序列進(jìn)行分析,證實(shí)先證者FV基因存在多種類型的基因突變,其中A327G、G495A、G642T和C3366G均為司義突變,未發(fā)生氨基酸的替代.G1628A、G2863A和C4279T分別引起R485→K、E897→K和L1369→F的氨基酸改變,但均為文獻(xiàn)報道的多態(tài)性位點(diǎn).位于內(nèi)含子區(qū)的堿基改變,由于均不發(fā)生在影響m

3、RNA加工的關(guān)鍵部位或其鄰近部位,所以可除外其作為FV缺乏癥的遺傳缺陷的可能.同時,鑒定到一種新的基因突變:雜合狀態(tài)的基因組DNA第4外顯子675位核苷酸單個堿基A缺失,即675DelA.FV基因第4外顯子位于FV蛋白A1區(qū)的編碼區(qū)域,第675位核苷酸A缺失后引起閱讀框改變,導(dǎo)致FV基因編碼170位亮氨酸(L)的密碼子CUA變?yōu)榻K止密碼子UAA,從而轉(zhuǎn)錄提前終止,理論上可產(chǎn)生一個長度小于170個氨基酸的短截多肽鏈,占正常FV分子的不足1

4、0％,僅含不完整的A1區(qū),幾無任何生物學(xué)活性.家系診斷結(jié)果顯示該缺陷來自先證者母親,其母和一個姐姐(S2)均為該缺失的雜合子.由此,推斷先證者為復(fù)合雜合子,來自父方的另外一條等位基因的未知缺陷,導(dǎo)致了先證者父親及另一個姐姐(S1)的血漿FV部分缺乏,并與來自母方的675DelA共同導(dǎo)致先證者血漿FV嚴(yán)重缺乏.此外,該研究中采用出血時間測定(bleeding time,BT)、APTT、PT、RIPA、FⅧ:Ag及vWF:Ag測定等方法,

5、對112名血小板計數(shù)正常的具有先天性出血傾向的患者進(jìn)行了臨床篩查.根據(jù)新的診斷和分型標(biāo)準(zhǔn),有10例患者臨床表現(xiàn)有初期止血障礙的出血特點(diǎn),主要表現(xiàn)為鼻衄、牙齦出血和皮膚瘀點(diǎn)、瘀斑,女性有月經(jīng)出血量增多,均未發(fā)現(xiàn)肌肉、關(guān)節(jié)和內(nèi)臟的出血.實(shí)驗(yàn)室檢查表現(xiàn)為:PT、TT正常,部分患者APTT輕度延長;vWF:Ag減低或正常;FⅧ:C正?；驕p低;瑞斯托霉素誘導(dǎo)的血小板聚集試驗(yàn)明顯或輕度降低,基本符合2A型血管性血友病的表型診斷.進(jìn)一步確診和精4確分