大鼠彌漫性腦創(chuàng)傷中海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞p-Cx43與神經(jīng)元自噬的相互調(diào)控作用及分子機(jī)制研究.pdf

1、創(chuàng)傷性腦損傷(Traumatic brain injury, TBI)是青壯年人群的主要死因，也是現(xiàn)代社會最主要的住院原因之一。外力損傷神經(jīng)元啟動一系列分子事件，導(dǎo)致腦組織水腫，神經(jīng)元死亡，運(yùn)動和認(rèn)知功能受損。腦外傷后神經(jīng)元自噬激活，加劇了腦損傷及神經(jīng)功能缺失。神經(jīng)元自噬參與了腦損傷的病理進(jìn)程，但是關(guān)于神經(jīng)元自噬的調(diào)控機(jī)制的研究甚少。目前國內(nèi)外研究主要集中于神經(jīng)元內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，關(guān)于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞對神經(jīng)元自噬的調(diào)控以及神經(jīng)元自噬對神經(jīng)膠

2、質(zhì)細(xì)胞的影響未見報道。
　　近年來研究發(fā)現(xiàn)，TBI引起星形膠質(zhì)細(xì)胞縫隙連接蛋白(connexin，Cx)表達(dá)明顯升高，進(jìn)而影響其形成的縫隙連接允許細(xì)胞內(nèi)小分子，離子及代謝物交換;TBI也引起星形膠質(zhì)細(xì)胞P2X7受體激活，導(dǎo)致腦水腫及神經(jīng)損傷;TBI所引起神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞膜上的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1蛋白（glial glutamatetransporter1，GLT-1）表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞外興奮性氨基酸濃度升高，損傷神經(jīng)元。但是關(guān)于星形膠質(zhì)細(xì)胞

3、縫隙連接蛋白如何調(diào)控P2X7受體及谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體，從而導(dǎo)致神經(jīng)元自噬激活，影響突觸后電位的機(jī)制還未闡明。同時神經(jīng)元自噬激活是否對星形膠質(zhì)細(xì)胞的縫隙連接蛋白具有降解作用，從而自我調(diào)控，具有神經(jīng)保護(hù)功能，目前不得而知。本論文分三部分闡述。
　　第一部分大鼠彌漫性腦創(chuàng)傷中海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞p-Cx43對神經(jīng)元自噬的調(diào)控
　　目的:本部分研究選用成年SPF級雄性SD大鼠應(yīng)用改良Marmarou法制備閉合性彌漫性顱腦創(chuàng)傷大鼠模型，給予p

4、-Cx43特異性抑制劑甘珀酸(carbenoxolone，CBX)干預(yù)，檢測彌漫性腦創(chuàng)傷大鼠海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞中p-Cx43對神經(jīng)元自噬的影響。
　　方法:采用本實驗室改良Marmarou方法復(fù)制TBI大鼠模型。成年SPF級SD雄性大鼠192只數(shù)字隨機(jī)分組:①假手術(shù)組（Sham group）;②腦創(chuàng)傷組(TBI group);③腦創(chuàng)傷+溶劑組（Saline group）;④腦創(chuàng)傷+Carbenoxolone組(CBX group)

5、。取傷后3h、6h、24 h、48h4個時間點(diǎn)檢測下列指標(biāo):①HE染色觀察各組腦組織病理形態(tài)學(xué)改變;②免疫組織化學(xué)方法檢測海馬區(qū)p-Cx43和微管相關(guān)輕鏈-3(microtubule associatedproteinllight chain3，LC3)的蛋白定位表達(dá);③Western-blot法檢測海馬區(qū)p-Cx43和LC3Ⅱ的蛋白表達(dá);④免疫熒光雙標(biāo)法檢測海馬區(qū)p-Cx43和LC3的蛋白共定位情況。應(yīng)用Image Proplus6.

6、0，Image J和Image Lab4.1分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析測定。實驗中數(shù)據(jù)均用(x)±s表示，用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析，兩兩比較采用Dunnett-t檢驗，以P＜0.05，表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、光鏡下觀察大鼠腦創(chuàng)傷模型切片
　　1.1傷后大鼠腦組織大體觀察:傷后可見蛛網(wǎng)膜下腔出血以及少量腦室出血;腦實質(zhì)多見點(diǎn)狀出血，以腦干的背側(cè)多見，腦組織表面血管充血明顯，并可見腦組織腫脹及局

7、部腦挫傷。
　　1.2 HE染色觀察組織形態(tài)學(xué)的改變:Sham組大鼠海馬區(qū)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，排列整齊，神經(jīng)元數(shù)量多且形態(tài)正常;TBI24 h組和Saline溶劑組神經(jīng)元胞體腫脹明顯，胞漿染色淺淡，核皺縮濃染，細(xì)胞與細(xì)胞之間出現(xiàn)間隙，神經(jīng)元出現(xiàn)變性及壞死改變。CBX治療組較TBI組和Saline溶劑組相比，神經(jīng)元胞體腫脹緩解，及核濃縮明顯減輕，神經(jīng)元周圍間隙明顯較小。
　　2、海馬區(qū)p-Cx43和LC3免疫組化檢測結(jié)果

8、　　p-Cx43定位于海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)和胞膜中，Sham組偶見陽性細(xì)胞，著色淺淡。TBI24 h組和Saline溶劑組與Sham組比較，傷后p-Cx43陽性細(xì)胞顯著增多，著棕色加深，免疫反應(yīng)性增強(qiáng)(P＜0.05)。CBX治療組p-Cx43免疫反應(yīng)性明顯減弱(P＜0.05);LC3定位于海馬區(qū)神經(jīng)元的胞質(zhì)，Sham組可見少量陽性細(xì)胞，且胞漿著色淺淡。TBI24 h組和Saline溶劑組與Sham組比較，LC3陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多，胞

9、漿呈現(xiàn)深棕色，免疫反應(yīng)性明顯增強(qiáng)(P＜0.05)。與TBI組和Saline溶劑組相比，CBX治療組LC3免疫反應(yīng)性明顯減弱(P＜0.05)。
　　3、海馬區(qū)p-Cx43和LC3的Westem blot檢測結(jié)果
　　Sham組p-Cx43蛋白表達(dá)量在各時間點(diǎn)無變化;TBI組和Saline溶劑組p-Cx43蛋白表達(dá)量隨著傷后時間的推移，逐漸增高，與Sham組比較，傷后3h開始顯著升高(P＜0.05)，6h達(dá)高峰，高表達(dá)狀態(tài)持續(xù)至

10、傷后24 h(P＜0.05)。CBX治療組各時間點(diǎn)蛋白表達(dá)趨勢與TBI和Saline組相似，但表達(dá)量明顯降低(P＜0.05)。Cx43總蛋白表達(dá)量在腦創(chuàng)傷后各時間點(diǎn)無變化。Sham組LC3Ⅱ的有微量的蛋白表達(dá)，且各時間點(diǎn)無差異;與Sham組相應(yīng)時間點(diǎn)比較，TBI組和Saline溶劑組LC3Ⅱ的蛋白表達(dá)量顯著升高(P＜0.05)，且呈現(xiàn)一定的動態(tài)變化趨勢，于損傷6h開始升高，24h達(dá)高峰，持續(xù)至傷后48h。CBX治療組各時間點(diǎn)蛋白表達(dá)趨勢

11、與TBI和Saline組相似，但LC3ⅡI表達(dá)量明顯降低(P＜0.05)。
　　4、TBI后海馬區(qū)LC3與神經(jīng)元特異性標(biāo)記物(neuronal nuclei，NeuN)以及p-Cx43與星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記物（glial fibrillary acidic protein，GFAP）熒光雙標(biāo)檢測結(jié)果
　　激光共聚焦顯微鏡下可見LC3為DyLight488標(biāo)記的細(xì)胞胞漿綠色熒光，NeuN為DyLight594標(biāo)記的細(xì)胞核周紅

12、色熒光?？梢姾ｑR區(qū)綠色熒光與紅色熒光大部分重疊，呈現(xiàn)橙色聚集，并基本完全重合，說明自噬主要發(fā)生在神經(jīng)元。激光共聚焦顯微鏡下P-Cx43為DyLight488標(biāo)記的細(xì)胞胞漿綠色熒光，GFAP為DyLight594標(biāo)記的星形膠質(zhì)細(xì)胞紅色熒光，在海馬區(qū)重疊呈橙色聚集，說明P-Cx43定位于星形膠質(zhì)細(xì)胞。
　　小結(jié):改良的Marmarou彌漫性腦創(chuàng)傷模型滿足了本實驗對P-Cx43和LC3的研究;大鼠腦創(chuàng)傷后，P-Cx43和LC3蛋白表達(dá)持

13、續(xù)升高，并且免疫反應(yīng)性增強(qiáng)，P-Cx43定位于海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞，LC3定位于海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞，給予縫隙連接阻斷劑CBX同時抑制P-Cx43和LC3蛋白表達(dá)及免疫反應(yīng)性，改善了腦損傷后神經(jīng)元腫脹及核濃縮，具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。
　　第二部分大鼠彌漫性腦創(chuàng)傷中海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞p-Cx43通過激活P2RX7和下調(diào)GLT-1表達(dá)對神經(jīng)元自噬調(diào)控的分子機(jī)制研究
　　目的:p-Cx43如何通過P2RX7和谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體GLT-1調(diào)控

14、神經(jīng)元自噬，以及對海馬興奮性突觸后電位和空間學(xué)習(xí)記憶的影響。
　　方法:大鼠模型同上，將156只成年SPF級雄性SD大鼠隨機(jī)分成6組:①假手術(shù)組(n=36)，②腦創(chuàng)傷組(n=66)③腦創(chuàng)傷24 h+Saline溶劑組(n=24)(④腦創(chuàng)傷24 h+CBX抑制劑組(n=6)⑤腦創(chuàng)傷24h+OxATP抑制劑組(n=12)⑥腦創(chuàng)傷24h+Ceftriaxone組(n=12)。術(shù)后時間點(diǎn)同上。檢測①免疫組織化學(xué)法檢測海馬區(qū)P2X7、GLT

15、-1的蛋白表達(dá)、定位;②激光共聚焦法檢測p-Cx43、P2X7、GLT-1的蛋白共定位情況;③Western-blot法檢測P2X7、GLT-1和LC3的蛋白表達(dá)量。另取30只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、腦創(chuàng)傷24 h組，腦創(chuàng)傷24 h+Saline溶劑組，腦創(chuàng)傷24 h+CBX抑制劑組，腦創(chuàng)傷24 h+3-MA(3-methyladenine)抑制劑組，記錄海馬腦片興奮性突觸后電位，Clampfit10.0檢測其長時程增強(qiáng)(LTP,long

16、-term potentiation)的變化。再取30只大鼠行水迷宮測試，隨機(jī)分為假手術(shù)組、腦創(chuàng)傷14d組，腦創(chuàng)傷14 d+Saline溶劑組，腦創(chuàng)傷14 d+CBX抑制劑組，腦創(chuàng)傷14 d+3-MA抑制劑組，檢測其空間學(xué)習(xí)記憶能力，使用Smart軟件記錄分析潛伏期。定量分析和統(tǒng)計同上。
　　結(jié)果:
　　1、Morris水迷宮結(jié)果
　　使用Morris水迷宮檢測大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。TBI組和Saline溶劑組傷后第1

17、4 d較Sham組相比大鼠搜索安全島潛伏期明顯延長(P＜0.05)。CBX抑制劑組和3-MA抑制劑組傷后第14 d搜索安全島運(yùn)動軌跡均較TBI組和Saline溶劑組明顯改善，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2、長時程增強(qiáng)(LTP)結(jié)果
　　使用長時程增強(qiáng)檢測長時記憶有重要意義。TBI24 h組和Saline溶劑組傷后興奮性突觸后電位幅度、斜率較Sham組均明顯降低、減小，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。CBX抑

18、制劑組和3-MA抑制劑組傷后突觸后電位幅度、斜率均較TBI24 h組和 Saline溶劑組明顯增高、加大,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3、海馬區(qū)P2X7受體和GLT-1免疫組化檢測結(jié)果
　　P2X7受體定位于海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞膜上，Sham組可見陽性細(xì)胞，著棕色。TBI24 h組和Saline溶劑組與Sham組比較，傷后P2X7受體陽性細(xì)胞無顯著增多(P＞0.05)。OxATP治療組P2X7受體免疫反應(yīng)性無

19、明顯改變(P＞0.05);GLT-1定位于海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞膜，Sham組可見陽性細(xì)胞，著棕色。TBI24 h組和Saline溶劑組與Sham組比較，傷后GLT-1陽性細(xì)胞數(shù)顯著減少，胞膜呈現(xiàn)淺棕色，免疫反應(yīng)性減弱(P＜0.05)。Cef治療組GLT-1免疫反應(yīng)性明顯增強(qiáng)(P＜0.05)。
　　4、腦創(chuàng)傷后24 h海馬區(qū)P-Cx43、P2X7、GLT-1與GFAP的激光共聚焦檢測結(jié)果
　　海馬區(qū)p-Cx43為DyLigh

20、t647標(biāo)記的陽性細(xì)胞胞漿紫色熒光，P2X7為DyLight488標(biāo)記的陽性細(xì)胞胞膜為綠色熒光，星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GFAP為DyLight594標(biāo)記的紅色熒光，三色Merge呈黃色，說明p-Cx43、P2X7共定位于星形膠質(zhì)細(xì)胞;海馬區(qū)GLT-1為DyLight647標(biāo)記陽性細(xì)胞胞膜為紫色熒光，P2X7為DyLight488標(biāo)記陽性細(xì)胞胞膜為綠色熒光，星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GFAP為DyLight594標(biāo)記紅色熒光，三色Merge呈黃色，說

21、明GLT-1、P2X7也共定位于星形膠質(zhì)細(xì)胞。
　　5、Western blot檢測結(jié)果
　　TBI24 h組和Saline溶劑組與Sham組相比LC3Ⅱ的蛋白表達(dá)量升高，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);TBI24 h+CBX抑制劑組、OxATP抑制劑組、Ceftriaxone組LC3Ⅱ的蛋白表達(dá)與TBI24 h組和Saline溶劑組相比表達(dá)量下降，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。TBI組與Sham組比較，傷后6

22、 h GLT-1蛋白量顯著降低(P＜0.05)，傷后24 h達(dá)高峰;TBI24 h組和Saline溶劑組與Sham組相比GLT-1的蛋白表達(dá)量降低，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05); TBI24 h+CBX抑制劑組、OxATP抑制劑組GLT-1的蛋白表達(dá)與TBI24 h組和Saline溶劑組相比表達(dá)量升高，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。TBI組與Sham組比較，傷后P2X7蛋白量無顯著變化(P＞0.05); TBI24 h組

23、和Saline溶劑組與Sham組相比P2X7的蛋白表達(dá)量無組間差異(P＞0.05); TBI24 h+CBX抑制劑組P2X7的蛋白表達(dá)與TBI24h組和 Saline溶劑組相比組間無差異(P＞0.05)。
　　小結(jié):大鼠彌漫性腦創(chuàng)傷后海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞p-Cx43通過激活P2X7受體，下調(diào)GLT-1蛋白表達(dá)，調(diào)控神經(jīng)元自噬，從而影響海馬區(qū)長時程記憶及空間學(xué)習(xí)記憶能力。
　　第三部分大鼠彌漫性腦創(chuàng)傷中海馬區(qū)神經(jīng)元自噬對星形膠質(zhì)

24、p-Cx43降解作用
　　目的:通過大鼠彌漫性腦創(chuàng)傷中海馬區(qū)神經(jīng)元自噬對星形膠質(zhì)細(xì)胞p-Cx43降解機(jī)制的研究，闡明不但海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞對神經(jīng)元具有調(diào)控作用，同時神經(jīng)元也對星形膠質(zhì)細(xì)胞具有一定調(diào)節(jié)作用。
　　方法:將120只成年雄性SD大鼠隨機(jī)分成4組:①假手術(shù)組(n=30)，②腦創(chuàng)傷組(n=36)③腦創(chuàng)傷+Saline溶劑組(n=24)④腦創(chuàng)傷+3-MA抑制劑組(n=30)。每組又分別劃分為傷后3h、6h、24h、48h

25、4個時間點(diǎn)。檢測①免疫熒光雙標(biāo)法檢測GFAP、LC3和p-Cx43的蛋白表達(dá)定位情況;②Western-blot法檢測LC3和P-Cx43的蛋白表達(dá)量;③透射電鏡檢測神經(jīng)元自噬體對縫隙連接的吞噬。分析和統(tǒng)計同前。
　　結(jié)果:
　　1、海馬區(qū)LC3和p-Cx43的Western blot檢測結(jié)果
　　Sham組LC3Ⅱ/β-actin的比值在各時間點(diǎn)無變化;與Sham組比較，傷后6h開始TBI組LC3Ⅱ/β-actin的

26、比值逐漸升高，24 h達(dá)峰值，48 h仍高表達(dá)，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05); TBI組與Saline溶劑組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);3-MA抑制劑組LC3Ⅱ/β-actin比值變化趨勢與TBI組相似，但比值明顯變小，傷后6h、24 h和48h差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。p-Cx43的表達(dá)在TBI組各個時間點(diǎn)與Sham組比較，傷后3h開始升高，持續(xù)到傷后24 h，組間蛋白量表達(dá)有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);

27、TBI組與Saline溶劑組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);3-MA抑制劑組p-Cx43明顯變大，與TBI組和Saline溶劑組比較傷后6h和24 h差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2、腦創(chuàng)傷后海馬區(qū)GFAP、LC3和p-Cx43的激光共聚焦檢測結(jié)果
　　海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GFAP為DyLight488標(biāo)記的綠色熒光，LC3為DyLight673標(biāo)記的陽性細(xì)胞胞漿紫色熒光，p-Cx43為DyLight5

28、94標(biāo)記的陽性細(xì)胞胞漿紅色熒光，用DAPI行海馬區(qū)細(xì)胞藍(lán)色核染色。在sham組LC3紫色和P-Cx43紅色數(shù)量少;TBI組LC3紫色和p-Cx43紅色陽性強(qiáng)度都增加明顯;3-MA抑制劑組LC3紫色陽性強(qiáng)度較TBI組明顯減少，但p-Cx43紅色陽性強(qiáng)度較TBI組又明顯增加。LC3紫色主要定位于海馬區(qū)神經(jīng)元;P-Cx43紅色與GFAP綠色Merge成橙色分布于海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞。
　　3、透射電鏡的檢測結(jié)果
　　我們使用透射電鏡

29、對腦創(chuàng)傷24 h后大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細(xì)胞縫隙連接超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察顯示:神經(jīng)元細(xì)胞漿內(nèi)靠近縫隙連接處可見自噬溶酶體結(jié)構(gòu)。
　　小結(jié):大鼠彌漫性腦創(chuàng)傷后，抑制海馬區(qū)神經(jīng)元自噬導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞p-Cx43表達(dá)升高;透射電鏡可見海馬區(qū)神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細(xì)胞縫隙連接旁自噬溶酶體的存在。揭示大鼠彌漫性腦創(chuàng)傷后海馬區(qū)神經(jīng)元自噬對星形膠質(zhì)細(xì)胞p-Cx43的表達(dá)具有降解作用。
　　結(jié)論:
　　大鼠彌漫性腦創(chuàng)傷中海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞P