載骨形態(tài)發(fā)生蛋白2活性肽的納米仿生骨基質(zhì)材料的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、我國(guó)每年因創(chuàng)傷和疾病所致骨缺損患者達(dá)數(shù)百萬(wàn),急需大量骨修復(fù)材料。近年來(lái)，運(yùn)用生物材料和骨組織工程學(xué)技術(shù)，即用人工細(xì)胞外基質(zhì)材料、生長(zhǎng)因子與種子細(xì)胞復(fù)合移植或單獨(dú)植入修復(fù)骨缺損，引起各國(guó)高度重視。但目前國(guó)內(nèi)外骨組織工程學(xué)研究尚處于起步階段，有許多問(wèn)題亟待解決，其中如何研制出具有特定結(jié)構(gòu)和骨誘導(dǎo)活性的仿生骨基質(zhì)材料是亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題之一。從材料科學(xué)角度講，天然骨基質(zhì)可看作是有機(jī)/無(wú)機(jī)納米復(fù)合多孔材料，有機(jī)成分主要為膠原，無(wú)機(jī)成分主要為含碳

2、酸根的羥基磷灰石(Hydroxyapatite,HA)。天然骨基質(zhì)的形成實(shí)際上是一個(gè)典型的有機(jī)基質(zhì)介導(dǎo)的生物礦化過(guò)程，HA 納米晶體是以膠原纖維為模板，成核生長(zhǎng)并自組裝而成。其中促發(fā)并指導(dǎo)礦化的功能位點(diǎn)是一類富含天冬氨酸或磷酸絲氨酸的磷蛋白。天然骨基質(zhì)這種特定的納米自組裝結(jié)構(gòu)和所攜帶的生長(zhǎng)因子等分子誘導(dǎo)信號(hào)，不僅使其具備了很好的強(qiáng)度與骨傳導(dǎo)活性,而且能通過(guò)特定的細(xì)胞通訊與信息傳遞系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞的粘附和向成骨方向定向分化等生物學(xué)行為進(jìn)行精確的

3、調(diào)控，即骨誘導(dǎo)活性。但目前尚無(wú)一種人工骨材料具有這樣精巧的納米結(jié)構(gòu)和良好的生物學(xué)活性，特別是骨誘導(dǎo)活性。例如，聚（丙交酯-co-乙交酯）（PLGA）是目前骨組織工程學(xué)研究中應(yīng)用最多的細(xì)胞基質(zhì)材料，具有良好的生物相容性和可控生物降解性，但其力學(xué)強(qiáng)度尚欠佳；表面疏水性較強(qiáng)、對(duì)細(xì)胞的粘附能力仍需提高、細(xì)胞——材料界面總是存在不相容問(wèn)題；更重要的是生物學(xué)活性不理想，缺乏骨傳導(dǎo)、骨誘導(dǎo)活性。近年來(lái)，運(yùn)用仿生礦化原理和納米自組裝技術(shù)制備有機(jī)/無(wú)機(jī)納

4、米復(fù)合材料，并將多肽﹑生長(zhǎng)因子等特定分子識(shí)別信號(hào)固定在材料表面，研制成新一代有特定結(jié)構(gòu)和功能的仿生“智能”基質(zhì)材料，以從納米水平誘導(dǎo)人們所需的特異性、可控性生物應(yīng)答，是當(dāng)今組織工程學(xué)和生物材料學(xué)研究領(lǐng)域的前沿課題。本課題擬在原有基礎(chǔ)上，進(jìn)一步運(yùn)用仿生礦化原理和納米自組裝技術(shù)，通過(guò)PLGA改性，合成聚丙交酯/乙交酯/天冬氨酸-聚乙二醇（簡(jiǎn)稱(PLGA-(PEG-ASP)n）多元共聚物；同時(shí)人工合成BMP-2活性肽P24，將其與改性PLGA

5、多孔基質(zhì)材料共價(jià)結(jié)合，在改良模擬體液中自組裝礦化生成納米晶HA，研制出類似天然骨基質(zhì)的具有特定納米自組裝結(jié)構(gòu)和骨誘導(dǎo)活性的載BMP-2活性肽納米晶羥基磷灰石/PLGA-(PEG-ASP)n仿生骨基質(zhì)材料。為此，本文進(jìn)行了以下兩部分的實(shí)驗(yàn)研究：
　　 一、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2活性肽的骨誘導(dǎo)活性的初步實(shí)驗(yàn)研究。
　　 目的：研究骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(簡(jiǎn)稱BMP-2)活性肽P24的骨誘導(dǎo)活性。
　　 方法：此多肽通過(guò)FMOC/

6、tBu固相多肽合成法合成，通過(guò)質(zhì)譜分析和色譜分析確定其分子量和純度。將BMP-2活性肽P24以生理鹽水溶解，以0.4mg及0.1mg的不同劑量滴加于膠原海綿上，充分吸收后凍干備用。在Wistar大鼠背部一側(cè)骶棘肌內(nèi)植入0.4mg多肽/膠原海綿材料或0.1mg多肽/膠原海綿材料作為兩實(shí)驗(yàn)組，對(duì)側(cè)骶棘肌內(nèi)植入單純膠原海綿作為對(duì)照組。術(shù)后3、6、8周取材，通過(guò)X線、CT以及組織學(xué)檢查，觀察分析異位骨形成情況及其時(shí)效和量效關(guān)系。
　　

7、結(jié)果：兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組植入材料的部位均可見(jiàn)新骨的生成，并呈劑量和時(shí)間依賴性。0.4mg多肽/膠原海綿組可見(jiàn)明顯新骨形成，具有活躍的成骨細(xì)胞和發(fā)育很充分的骨小梁組織。0.1mg多肽/膠原海組可見(jiàn)相對(duì)較少的新骨形成。對(duì)照的單純膠原海綿材料處僅見(jiàn)纖維組織形成，未見(jiàn)成骨。
　　 結(jié)論：BMP-2活性肽P24能誘導(dǎo)異位成骨，具有與BMP-2類似的骨誘導(dǎo)活性。
　　 二、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2活性肽修飾的納米仿生骨基質(zhì)材料的實(shí)驗(yàn)研究。
　

8、　 1.模擬生物礦化過(guò)程制備羥基磷灰石/PLGA-(PEG-ASP)n骨基質(zhì)材料。
　　 目的：運(yùn)用仿生礦化原理和自組裝技術(shù)，觀察在聚（丙交酯-co-乙交酯）(PLGA)分子鏈中同時(shí)引入親水性強(qiáng)的聚乙二醇(PEG)鏈段及能促發(fā)生物礦化的功能基團(tuán)天冬氨酸(ASP)后，所合成出的PLGA-(PEG-ASP)n新型嵌段共聚物在模擬體液中的礦化情況，以評(píng)價(jià)PLGA-(PEG-ASP)n材料的礦化能力，制備出具有與天然骨基質(zhì)相似微觀結(jié)構(gòu)

9、的骨基質(zhì)材料。
　　 方法：將PLGA-(PEG-ASP)n多孔基質(zhì)材料植入改良的模擬體液中，以PLGA 為對(duì)照，通過(guò)鈣離子吸附分析、掃描電鏡、材料質(zhì)量及磷酸鹽含量測(cè)定等方法對(duì)材料礦化情況進(jìn)行表征。
　　 結(jié)果：電鏡觀察可見(jiàn)在PLGA-(PEG-ASP)n支架材料表面及內(nèi)部多孔結(jié)構(gòu)內(nèi)逐漸有羥基磷灰石晶體的沉積，16天時(shí)已呈現(xiàn)連續(xù)的礦化層，高倍下礦化晶體呈薄片狀分頁(yè)結(jié)構(gòu)，與天然骨基質(zhì)礦物相微觀結(jié)構(gòu)相似；PLGA材料表面僅見(jiàn)

10、微量礦物沉積。PLGA-(PEG-ASP)n支架材料在模擬體液各個(gè)時(shí)段中鈣離子吸附量、材料總體質(zhì)量及磷酸鹽含量均顯著高于PLGA材料。
　　 結(jié)論：在PLGA分子鏈中同時(shí)引入PEG鏈段及ASP功能基團(tuán)，在改善材料的親水性的同時(shí)，為促發(fā)和指導(dǎo)礦化提供了豐富的功能基團(tuán)，獲得了與天然骨基質(zhì)相似的微觀結(jié)構(gòu)，既可能提高材料強(qiáng)度，又提高了材料與骨組織間的界面相容性。
　　 2. PLGA-(PEG-ASP)n材料負(fù)載骨形態(tài)發(fā)生蛋白2

11、活性肽的實(shí)驗(yàn)研究。
　　 目的：將BMP-2活性肽P24通過(guò)交聯(lián)劑碳化二亞胺(EDC)及N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)共價(jià)結(jié)合于PLGA-(PEG-ASP)n材料上，初步評(píng)價(jià)載BMP-2活性肽P24的PLGA-(PEG-ASP)n材料的礦化能力。
　　 方法：將BMP-2活性肽P24通過(guò)交聯(lián)劑EDC及NHS共價(jià)結(jié)合于PLGA-(PEG-ASP)n 材料上作為實(shí)驗(yàn)組，以活性肽P24物理涂覆后的聚合物為對(duì)照組，通過(guò)X射線光電子

12、光譜法和掃描電鏡檢測(cè)交聯(lián)情況，同時(shí)對(duì)兩組材料進(jìn)行了鈣離子吸附實(shí)驗(yàn)。
　　 結(jié)果：XPS檢測(cè)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組材料表面均已結(jié)合硫元素，兩者含有硫元素含量分別為1.5%及0.09%；鈣離子吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，12h及24h時(shí)實(shí)驗(yàn)組材料的鈣離子吸附量分別為0.126mg 及0.231mg；12h 及24h時(shí)對(duì)照組材料的鈣離子吸附量分別為0.053mg、0.102mg。多肽交聯(lián)之材料較物理涂覆之材料的鈣離子吸附能力顯著增強(qiáng)。24h時(shí)

13、通過(guò)掃描電鏡可觀察到兩組材料表面離子吸附情況存在明顯差異。
　　 結(jié)論：EDC及NHS能將BMP-2活性肽P24共價(jià)載于PLGA-(PEG-ASP)n材料上。載BMP-2活性肽P24的PLGA-(PEG-ASP)n材料對(duì)鈣離子的吸附能力顯著增強(qiáng)，為下一步誘導(dǎo)納米晶羥基磷灰石的自組裝和生物礦化，制備出納米晶羥基磷灰石/PLGA-(PEG-ASP)n仿生骨基質(zhì)材料奠定了良好基礎(chǔ)。
　　 3. 載骨形態(tài)發(fā)生蛋白2活性肽的納米晶

14、羥基磷灰石/PLGA-(PEG-ASP)n仿生骨基質(zhì)材料的制備。
　　 目的：運(yùn)用仿生礦化原理和自組裝技術(shù)，觀察載BMP-2活性肽P24的PLGA-(PEG-ASP)n嵌段共聚物在模擬體液中的礦化情況，以制備出具有與天然骨基質(zhì)相似微觀結(jié)構(gòu)和骨誘導(dǎo)活性的仿生骨基質(zhì)材料。
　　 方法：將載BMP-2活性肽P24的PLGA-(PEG-ASP)n多孔基質(zhì)材料植入改良的模擬體液中，以PLGA-(PEG-ASP)n材料為對(duì)照，10天

15、后通過(guò)掃描電鏡、X射線能譜分析及X 射線衍射儀等對(duì)材料礦化情況進(jìn)行表征。
　　 結(jié)果：10天后電鏡觀察可見(jiàn)在載BMP-2活性肽P24的PLGA-(PEG-ASP)n支架材料表面及內(nèi)部多孔結(jié)構(gòu)內(nèi)已呈現(xiàn)連續(xù)的礦化層，較為致密；PLGA-(PEG-ASP)n支架材料表面僅見(jiàn)分散的礦化層，較為稀疏。X射線能譜分析及X射線衍射分析表明礦化物主要成分為羥基磷灰石(HA)，鈣磷比為1.60，類似于人骨無(wú)機(jī)質(zhì)。
　　 結(jié)論：PLGA-(