ACE2-AnG-(1-7)-Mas受體軸對(duì)肝星狀細(xì)胞收縮及門靜脈高壓的調(diào)控機(jī)制.pdf

1、研究背景和目的:各種慢性肝病可經(jīng)肝纖維化發(fā)展為肝硬化，門靜脈高壓是肝硬化的嚴(yán)重并發(fā)癥。肝硬化狀態(tài)下，肝內(nèi)血管阻力的增加是導(dǎo)致門靜脈高壓的重要因素。肝星狀細(xì)胞(hepaticstellatecell，HSC)在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展以及門脈高壓形成等一系列過(guò)程中起至關(guān)重要的作用。肝損傷時(shí)HSC被激活轉(zhuǎn)化成肌成纖維樣細(xì)胞表型，并獲得收縮性。收縮的HSC一方面可致肝竇直徑縮小，肝內(nèi)血管阻力增大;另一方面引起肝組織瘢痕攣縮，進(jìn)一步增加肝內(nèi)血管阻力，

2、導(dǎo)致門靜脈高壓。因此HSC的收縮調(diào)控是研究門脈高壓機(jī)制的重要因素。
　　 目前研究證實(shí)，HSC的收縮主要通過(guò)非鈣途徑進(jìn)行，而在非鈣途徑中RhoA/ROCK信號(hào)通路是近年研究的熱點(diǎn)。Rho族蛋白主要通過(guò)調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白和細(xì)胞骨架的重組，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的收縮和運(yùn)動(dòng)。而RhoA/ROCK通路對(duì)NO/PKG通路有負(fù)性調(diào)節(jié)作用。激活的RhoA/ROCK通過(guò)抑制eNOS的活性而促進(jìn)HSC收縮，從而增加肝內(nèi)血管阻力，促進(jìn)肝硬化門靜脈高壓的形成。

3、r>　　 肝內(nèi)腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)是肝纖維化研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。肝臟等局部組織器官具有RAAS，肝內(nèi)ACE-AngⅡ-AT1R軸的上調(diào)可誘導(dǎo)HSC的活化，加重肝損傷，促進(jìn)肝纖維化形成及門脈高壓。ACE2-Ang-(1-7)-Mas受體軸是新發(fā)現(xiàn)的RAAS組分，對(duì)ACE-AngⅡ-AT-1受體軸有顯著抑制作用。同時(shí)對(duì)心、肺、腎、肝的損傷及纖維化具有保護(hù)作用。Ang-(1-7)在體內(nèi)外能與AT1R競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，拮抗AngⅡ的

4、活性。另外Ang-(1-7)與Mas受體結(jié)合后，可促進(jìn)NO合成引起血管舒張。
　　 因此，本研究的目的旨在①通過(guò)體外試驗(yàn)，觀察ACE2-Ang(1-7)-Mas受體軸通過(guò)調(diào)節(jié)RhoA/ROCK、NO/PKG信號(hào)通路上各元件的表達(dá)對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的HSC收縮的影響;②通過(guò)體內(nèi)試驗(yàn)，觀察Ang-(1-7)對(duì)肝纖維化引起的肝星狀細(xì)胞收縮的影響，及參與門脈高壓調(diào)控的分子機(jī)制。
　　 方法:
　　 1.ACE2-Ang-(1

5、-7)-Mas受體軸對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞系收縮的影響采用HSC-T6細(xì)胞株，電子顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化;Ⅰ型鼠尾膠原法(TypeⅠrat-tailcollagen)觀察HSC-T6的收縮;激光共聚焦顯微鏡下觀察TRITC-鬼筆環(huán)肽(TRITC-phalloidin)標(biāo)記肌動(dòng)蛋白(F-actin)顯示微絲骨架在細(xì)胞中的分布和動(dòng)態(tài)變化。
　　 2.ACE2-Ang-(1-7)-Mas受體軸抑制AngⅡ誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞收縮機(jī)制的體外研究

6、
　　 采用HSC-T6細(xì)胞株，分別給予AT1R阻斷劑(10nMIrbesartan)、Mas受體阻滯劑(10nMA779)、ROCK-2抑制劑(10nMY27632)預(yù)處理1h，AngⅡ(1nM)與Ang-(1-7)(1nM)、AngⅡ(1nM)+Ang-(1-7)(1nM)與A779(10nM)、AngⅡ(1nM)與Y27632(10nM)、AngⅡ(1nM)與Irb(10nM)共處理15min后，Pull-downGST法

7、提取不同組別RhoAGTP活性蛋白，免疫印記法檢測(cè)RhoAGTP蛋白表達(dá)水平;分別提取不同組別細(xì)胞膜蛋白，免疫印跡法檢測(cè)Ras、RhoA蛋白表達(dá)水平;提取不同組別細(xì)胞總蛋白，免疫印跡法檢測(cè)RhoA/ROCK通路上Phosphorylationofmoesin(P-moesin)和moesin、P-MLC和MLC蛋白表達(dá)水平;NO/PKG通路上P-VASP和VASP、P-eNOS和eNOS蛋白表達(dá)水平;提取不同組別細(xì)胞內(nèi)RNA，逆轉(zhuǎn)錄為c

8、DNA，熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(QuantitativeReal-timePCR,Q-PCR)檢測(cè)促纖維化基因CTGF的表達(dá)。構(gòu)建ACE2siRNA和lenti-ACE2慢病毒載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，免疫印記法檢測(cè)RhoA/ROCK通路及NO/PKG通路上各蛋白水平。
　　 3.Ang-(1-7)抑制肝星狀細(xì)胞收縮對(duì)門脈高壓調(diào)控機(jī)制的體內(nèi)研究構(gòu)建假手術(shù)組大鼠模型(sham)、膽管結(jié)扎肝纖維化組大鼠模型(BDL)及BDL基礎(chǔ)上Ang-(1-7

9、)治療組模型(BDL+Ang-(1-7))，通過(guò)對(duì)肝組織HE染色及Masson染色進(jìn)行ISHAK及METAVIR肝纖維化評(píng)分;羥脯氨酸含量測(cè)定;免疫組化法及免疫印跡法檢測(cè)RhoA/ROCK通路及NO/PKG通路上各蛋白表達(dá);Q-PCR法檢測(cè)RhoA/ROCK通路上RhoGEFs(RhoGuanineNucleotideExchangeFactors，RhoGEFs)、RhoAGTP及ROCK-2(Rhokinase)mRNA的表達(dá)以及N

10、O/PKG通路上eNOsmRNA的水平。彩色多普勒血流超聲檢測(cè)(CDFI)檢測(cè)肝門靜脈血流速度及肝門靜脈內(nèi)徑;原位肝灌注法檢測(cè)肝外門靜脈壓力及肝內(nèi)血管阻力。
　　 結(jié)果:
　　 1.ACE2-Ang(1-7)-Mas受體軸抑制AngⅡ誘導(dǎo)的HSC-T6細(xì)胞收縮在電子掃描顯微鏡下可見(jiàn)Ang-(1-7)及Irb能夠抑制細(xì)胞伸展和體積增大;激光共聚焦顯微鏡觀察可見(jiàn)經(jīng)FITC-phalloidine染色的細(xì)胞骨架中的微絲(F-a

11、ctin)，Ang-(1-7)、Irb及Y27632能夠顯著抑制AngⅡ誘導(dǎo)的F-actin數(shù)量增多;Ⅰ型鼠尾膠原法可觀察到AngⅡ可誘導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞收縮，而Ang-(1-7)、Irb及Y27632能夠抑制AngⅡ誘導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞收縮的效應(yīng)。
　　 2.ACE2-Ang-(1-7)-Mas受體軸抑制AngⅡ誘導(dǎo)HSC-T6收縮機(jī)制的體外研究在蛋白水平，ACE2-Ang-(1-7)-Mas受體軸能夠顯著抑制AngⅡ誘導(dǎo)的R

12、hoAGTP活性蛋白(P=0.001)、moesin蛋白磷酸化(P=0.000)、MLC蛋白磷酸化(P=0.000)及α-SMA增高水平，而Y27632(RhoA激酶抑制劑)也能夠顯著降低RhoAGTP活性蛋白(P=0.000)、moesin蛋白磷酸化(P=0.000)水平;在基因表達(dá)水平，AngⅡ處理組CTGFmRNA(P=0.000)的表達(dá)顯著增強(qiáng)，Ang-(1-7)處理組表達(dá)顯著減弱(均P＜0.01)。AngⅡ+Ang-(1-7)

13、、AngⅡ+Irb、AngⅡ+Y27632聯(lián)合處理組均能夠顯著減低上述元件的表達(dá)水平(均P＜0.001)。
　　 同時(shí)，本研究成功構(gòu)建ACE2siRNA和lenti-ACE2慢病毒載體。結(jié)果顯示:lenti-ACE2感染HSC-T6后，RhoA及其下游ROCK活性被顯著抑制。NO及其下游PKG活性顯著增強(qiáng)。ACE2siRNA轉(zhuǎn)染HSC-T6后，作用則相反。
　　 3.Ang(1-7)抑制肝星狀細(xì)胞收縮對(duì)門脈高壓調(diào)控機(jī)制的

14、體內(nèi)研究
　　 通過(guò)對(duì)Sham組、BDL組及BDL+Ang-(1-7)組大鼠肝組織HE染色及Masson染色進(jìn)行ISHAK及METAVIR肝纖維化評(píng)分發(fā)現(xiàn)，BDL組肝纖維化評(píng)分顯著高于Sham組(P=0.000)，而BDL+Ang-(1-7)組能夠顯著降低BDL組肝纖維化評(píng)分(P=0.000)，但兩者均較Sham組高;不同組別大鼠肝組織中羥脯氨酸(Hyp)及Ⅰ型膠原含量顯示，BDL組顯著高于Sham組(P=0.000)，而BDL

15、+Ang-(1-7)組顯著低于BDL組(P=0.000)。免疫組織化學(xué)法檢測(cè)蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)，BDL組肝臟P-moesin和α-SMA表達(dá)水平明顯增加，Ang-(1-7)治療組大鼠肝臟中P-moesin和α-SMA染色較膽管結(jié)扎組減弱，包括陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目及染色信號(hào)強(qiáng)度均減弱;在蛋白水平，BDL組大鼠肝組織內(nèi)RhoA/ROCK通路上RhoA、Ras、P-moesin及α-SMA蛋白表達(dá)水平均顯著升高(均P＜0.01)，Ang-(1-7)治療組P

16、-moesin及α-SMA蛋白水平下降，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.01)，而Ras及RhoA水平與BDL組無(wú)明顯差異;在NO/PKG通路上，Ang-(1-7)治療組P-eNOS與P-VASP表達(dá)明顯增高(均P=0.000)。在基因水平，BDL組大鼠肝組織內(nèi)RhoA/ROCK通路上RhoGEF、RhoA、ROCK-2mRNA的表達(dá)均顯著升高(均P=0.000);在NO/PKG通路中Ang-(1-7)治療組eNOSmRNA表達(dá)亦明顯增高(

17、P=0.000)。
　　 血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)變化在于:CDFI檢測(cè)可見(jiàn)BDL組較Sham組大鼠肝臟表面明顯不平、呈鋸齒狀或波浪狀，肝臟內(nèi)部回聲多表現(xiàn)增強(qiáng)，光點(diǎn)增粗，分布均勻或不均勻，有時(shí)見(jiàn)網(wǎng)狀較強(qiáng)回聲的分隔。肝靜脈可受擠壓變細(xì)或粗細(xì)不均勻。各組大鼠血流動(dòng)力學(xué)測(cè)定結(jié)果表明，BDL組大鼠肝門靜脈內(nèi)徑、肝門靜脈血流速度較Sham組均顯著性增加(P=0.000);同時(shí)，BDL組肝門靜脈壓力及肝內(nèi)血管阻力均顯著增高(P=0.000)，Ang-

18、(1-7)治療后肝門靜脈壓力及肝內(nèi)血管阻力均較前者顯著性下降(P=0.000)。
　　 結(jié)論:
　　 1.ACE2-Ang-(1-7)-Mas受體軸能夠抑制AngⅡ誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞收縮。
　　 2.ACE2-Ang-(1-7)-Mas受體軸能夠顯著抑制肝星狀細(xì)胞RhoA/ROCK通路上相關(guān)分子元件的表達(dá)水平，同時(shí)上調(diào)NO/PKG通路上相關(guān)分子元件的表達(dá)水平，從而抑制AngⅡ誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞收縮。
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