ACE2-Ang(1-7)-Mas通路介導(dǎo)的胰島內(nèi)皮細(xì)胞效應(yīng)對β細(xì)胞功能的作用及機制研究.pdf

1、目的：在2型糖尿病大鼠模型通過改變ACE2-Ang(1-7)-Mas 通路活性，觀察其胰島微循環(huán)變化，及其對胰島β細(xì)胞功能的影響。
　　 方法：長期高脂高熱量飲食加小劑量STZ 誘導(dǎo)2 型糖尿病大鼠模型，頸部皮下注射Ang(1-7)或加用其受體Mas 阻斷劑A-779（均為300μg·kg–1·d–1）以上調(diào)或阻斷ACE2-Ang(1-7)-Mas 通路活性，彩色微球法測胰腺微循環(huán)血流，免疫熒光染色檢測胰島內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志分子vWF

2、（von Willebrand factor）及胰島素蛋白水平表達，RT-PCR檢測胰島內(nèi)皮因子vWF基因水平表達，行腹腔葡萄糖耐量試驗（IPGTT）及其胰島素釋放試驗（IPIRT）。
　　 結(jié)果：與正常對照組相比，2 型糖尿病模型大鼠胰島形態(tài)不規(guī)則，邊界模糊，結(jié)構(gòu)紊亂，微循環(huán)血流量降低54.9％（P<0.01），內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)目顯著減少，甚至出現(xiàn)血管內(nèi)皮破裂，vWF 免疫熒光結(jié)果半定量分析相對濃度降低48.6％，vWFmRNA 相

3、對表達量下降17.6％（P<0.05）；空腹胰島素降低約29.4％（P<0.05），15min（第一時相）胰島素分泌峰值降低42.2％（P<0.01），免疫熒光染色示胰島素相對含量明顯下降（P<0.01）；空腹血糖、IPGTT 15min 血糖及AUCG（葡萄糖曲線下面積）均顯著升高。模型大鼠經(jīng)Ang(1-7)干預(yù)后，與其空白對照組相比，胰島內(nèi)皮完整性有所恢復(fù)，微循環(huán)血流量增加0.68倍（P<0.05）；vWF 蛋白相對含量與mRNA相

4、對表達量分別增加33％和32.7％（P<0.05）；空腹胰島素升高9.6％（P＞0.05），15min 胰島素分泌水平增加44.3％（P<0.05），胰島素相對含量增加23.6％；空腹血糖干預(yù)后較干預(yù)前下降（P<0.05），且其下降幅度較空白對照組增大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；IPGTT 15min 血糖降低9.7％（P<0.05），AUCG 降低7.4％（P<0.05）。Mas 受體阻斷劑A-779 可以顯著削弱Ang(1-7)干預(yù)帶來的上

5、述效應(yīng)，降低微循環(huán)血流量，空腹胰島素下降約4.8％（P＞0.05），15min 胰島素分泌水平降低約27.9％（P<0.05），胰島素相對含量減少，空腹血糖干預(yù)前后降低幅度減小，IPGTT基礎(chǔ)血糖及15min 血糖均升高，AUCG 升高11.5％（P<0.05）。
　　 結(jié)論：在2型糖尿病模型大鼠體內(nèi)行Ang(1-7)干預(yù)以上調(diào)ACE2-Ang(1-7)-Mas通路活性，可改善胰島內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)，增加胰腺微循環(huán)血流量，提高β細(xì)胞第

6、一時相胰島素分泌，并部分改善血糖水平。
　　 第二部分、ACE2-Ang(1-7)-Mas 通路介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞效應(yīng)對胰島β細(xì)胞功能的影響
　　 目的：觀察ACE2-Ang(1-7)-Mas 通路活性改變對糖尿病模型和單純肥胖模型大鼠體外分離胰島細(xì)胞的內(nèi)皮細(xì)胞功能、β細(xì)胞存活與功能的直接效應(yīng)，并比較這兩種模型大鼠胰島細(xì)胞對該通路的不同反應(yīng)。
　　 方法：建立糖尿病模型（DM）和單純肥胖模型（FC）大鼠，膠原酶法分離

7、胰島細(xì)胞，用含10％胎牛血清及抗生素的RPMI 1640 培養(yǎng)基進行體外靜態(tài)培養(yǎng)，并進行胰島計數(shù)及活率測定。研究Ang(1-7)的劑量-效應(yīng)關(guān)系及時間-效應(yīng)曲線。用最佳濃度的Ang(1-7)以最佳時間分別干預(yù)DM、FC 大鼠胰島細(xì)胞，并用Ang(1-7)受體Mas 阻斷劑A-779 阻斷ACE2-Ang(1-7)-Mas 通路活性，檢測其內(nèi)皮舒張因子一氧化氮（NO）含量，放免法檢測上清胰島素含量，離心收集胰島細(xì)胞行RT-PCR檢測早期凋

8、亡基因Bcl-2/Bax的表達水平，并行Hoechst 染色觀察其凋亡水平。
　　 結(jié)果：通過對Ang(1-7)的劑量-效應(yīng)及時間-效應(yīng)研究，發(fā)現(xiàn)Ang(1-7)10nM 處理胰島細(xì)胞6h是刺激胰島素分泌的最佳干預(yù)劑量及時間長度。Ang(1-7)干預(yù)能提高DM 大鼠和FC 大鼠胰島內(nèi)皮細(xì)胞所合成與釋放的NO的含量，分別為24.7％和31.7％ (P＜0.05)。經(jīng)Ang(1-7)10nM 干預(yù)6h后，DM組基礎(chǔ)胰島素分泌含量較其

9、對照組上升18.1％，但是差異無統(tǒng)計學(xué)意義；GSIS 較之升高36.5％（P<0.05）；FC組基礎(chǔ)胰島素分泌較其對照組降低13.2％，GSIS 升高至對照組的1.58倍（P<0.01）。而以A-779 100nM 阻斷Mas 受體的作用后，DM組和FC組基礎(chǔ)胰島素分泌及GSIS 均顯著減少。經(jīng)Ang(1-7)10nM 干預(yù)6h后，DM 大鼠和FC 大鼠胰島細(xì)胞的Bcl-2/Bax 比值均升高，分別為其對照組的2.01倍（P<0.05）

10、和1.55倍（P<0.05），并且細(xì)胞凋亡率也呈下降趨勢（P＞0.05）。
　　 結(jié)論：無論是在糖尿病前期狀態(tài)（FC）還是糖尿病狀態(tài)（DM）下，Ang(1-7)干預(yù)均能提高胰島內(nèi)皮細(xì)胞NO 合成與釋放，抑制胰島細(xì)胞凋亡。Ang(1-7)干預(yù)可以改善FC 大鼠胰島β細(xì)胞功能障礙，但其效應(yīng)對DM 大鼠胰島β細(xì)胞作用有限。
　　 第三部分、ACE-AngII-AT1R和ACE2-Ang(1-7)-Mas的相互平衡對胰島細(xì)胞功能

11、的作用及其機制研究
　　 目的：在體外離體胰島細(xì)胞上模擬ACE-AngII-AT1R和ACE2-Ang(1-7)-Mas 兩條通路的失衡并重建平衡，研究其內(nèi)皮細(xì)胞功能改變以及對β細(xì)胞存活與功能的作用和可能機制。
　　 方法：取正常大鼠胰島細(xì)胞進行體外培養(yǎng)，高糖環(huán)境誘導(dǎo)其凋亡狀態(tài)。分別予以AngII 干預(yù)（1組），AngII+Ang(1-7)干預(yù)（2組），AngII+Ang(1-7)+A-779 干預(yù)（3組）。檢測其內(nèi)皮舒

12、張因子一氧化氮（NO）含量，放免法檢測上清胰島素含量，離心收集細(xì)胞行RT-PCR檢測內(nèi)皮細(xì)胞來源的肝細(xì)胞生長因子（HGF）、胰腺十二指腸同源盒-1（PDX-1）mRNA和早期凋亡基因Bcl-2/Bax的表達水平，并行Hoechst 染色觀察其凋亡水平。
　　 結(jié)果：與正常對照組相比，高糖環(huán)境可使胰島內(nèi)皮細(xì)胞所合成與釋放的NO 含量降低40.7％（P<0.01），降低了β細(xì)胞葡萄糖刺激的胰島素分泌（GSIS）水平（P<0.05），

13、胰島細(xì)胞Bcl-2/Bax 相對比值降低約50％（P<0.05），細(xì)胞凋亡率顯著升高，HGF和PDX-1 mRNA的相對表達量分別降低9.5％和28.8％（P<0.05）。
　　 在此狀態(tài)下，AngII 干預(yù)更加降低胰島內(nèi)皮細(xì)胞NO 含量（P<0.05），抑制β細(xì)胞GSIS水平（P<0.05），使大鼠胰島內(nèi)皮細(xì)胞HGF mRNA 相對表達量下調(diào)25.4％（P<0.05）及胰島細(xì)胞PDX-1 mRNA 相對表達量下調(diào)9.8％（P<

14、0.05）。而上調(diào)培養(yǎng)液中Ang(1-7)水平后，與1組相比，2組大鼠胰島內(nèi)皮細(xì)胞合成與釋放的NO 含量增加至其1.56倍（P<0.05），β細(xì)胞GSIS 增加約97.8％（P<0.05），胰島細(xì)胞Bcl-2/Bax 相對比值提高26％（P<0.05），HGF與PDX-1mRNA的相對表達量升高分別為55.9％和30.7％（P<0.05）；若在培養(yǎng)液中再添加Ang(1-7)受體Mas 拮抗劑A-779，與2組相比，則胰島內(nèi)皮細(xì)胞合成與釋

15、放的NO 含量呈現(xiàn)出下降趨勢，胰島β細(xì)胞GSIS 減少，同時Bcl-2/Bax 相對比值降低，胰島細(xì)胞早期凋亡被觸發(fā)，并且HGF和PDX-1 mRNA表達均又受到抑制。
　　 結(jié)論：胰島ACE-AngII-AT1R和ACE2-Ang(1-7)-Mas 兩條通路的平衡可通過介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞效應(yīng)調(diào)節(jié)β細(xì)胞功能與增殖。ACE-AngII-AT1R 通路活性增加可損害內(nèi)皮細(xì)胞功能，抑制β細(xì)胞功能與增殖；而上調(diào)ACE2-Ang(1-7)-Ma