地衣芽胞桿菌木糖利用代謝工程.pdf

1、當(dāng)前社會(huì)發(fā)展面臨的能源和糧食危機(jī)使得人類對(duì)開(kāi)發(fā)利用纖維素生物質(zhì)資源寄予厚望，在發(fā)酵工業(yè)中以木質(zhì)纖維素或其降解物作為發(fā)酵原料降低發(fā)酵成本解決資源危機(jī)已成共識(shí)。木糖是木質(zhì)纖維素中含量?jī)H次于葡萄糖的單糖，但很多微生物代謝木糖能力不強(qiáng)，且在以葡萄糖和木糖等混合碳源發(fā)酵時(shí)，CCR效應(yīng)會(huì)抑制木糖的攝入利用。本研究旨在以本實(shí)驗(yàn)室保藏的地衣芽胞桿菌(Bacillus licheniformis)WX-02為出發(fā)菌株，構(gòu)建能高效穩(wěn)定利用木糖的工程菌株。<

2、br>　　為解除該菌株的CCR效應(yīng)使菌株能同時(shí)高效利用葡萄糖和木糖發(fā)酵，敲除基因ccpA得到缺失菌株WX-02△ccpA，考察在乙偶姻發(fā)酵培養(yǎng)基下缺失菌株與野生菌株的生長(zhǎng)狀況及乙偶姻的產(chǎn)量，發(fā)現(xiàn)缺失菌株的生長(zhǎng)嚴(yán)重受阻。已有報(bào)道表明細(xì)菌中受CRR效應(yīng)調(diào)控的基因數(shù)量龐大，可能該基因缺失干擾了與菌株生長(zhǎng)代謝極其重要的基因的表達(dá)，因此通過(guò)此方式解除CCR效應(yīng)是不合適的。
　　進(jìn)而考慮在野生菌株中敲除PTS系統(tǒng)中的ptsG和ptsH基因，得

3、到缺失菌株WX-02△ptsGH，使菌株不能產(chǎn)生CcpA的結(jié)合蛋白HPr，從而間接導(dǎo)致CcpA不能發(fā)揮作用。同樣在乙偶姻發(fā)酵培養(yǎng)基中考察該菌株的特性，缺失菌株生長(zhǎng)不受影響，且在只有葡萄糖情況下不影響菌株對(duì)葡萄糖的攝入利用，乙偶姻、丁二醇的產(chǎn)量也無(wú)顯著性差異;進(jìn)而在以60g/L葡糖糖和30g/L木糖為底物的乙偶姻發(fā)酵培養(yǎng)基中檢測(cè)上述指標(biāo)，結(jié)果表明葡萄糖都能在16h時(shí)耗完，木糖消耗水平和乙偶姻、丁二醇產(chǎn)量都無(wú)顯著性差異。這兩方面數(shù)據(jù)顯示pt

4、sGH的缺失對(duì)CCR效應(yīng)的解除未達(dá)到預(yù)期效果。
　　以上嘗試解除CCR效應(yīng)的策略都未起到預(yù)期的效果，則試圖通過(guò)增強(qiáng)木糖特異性轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)現(xiàn)預(yù)期目的，超表達(dá)B.subtilis來(lái)源的木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AraE，得到工程菌株WX-02pHYaraE，同樣在以60g/L葡糖糖和30g/L木糖為底物的乙偶姻發(fā)酵培養(yǎng)基中檢測(cè)上述指標(biāo)，結(jié)果表明工程菌株的木糖利用水平并未增強(qiáng)。
　　據(jù)此情況，選擇增強(qiáng)木糖代謝途徑中的關(guān)鍵酶來(lái)作進(jìn)一步探究，在WX-02

5、基礎(chǔ)上超表達(dá)其自身的木糖異構(gòu)酶XylA，木酮糖激酶XylB，得到工程菌株WX-02pT49xylA，WX-02pT49xylB，在同上培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下檢測(cè)菌株生長(zhǎng)狀況及木糖消耗水平，發(fā)現(xiàn)木糖消耗水平并未得到提升，且因?yàn)檗D(zhuǎn)入質(zhì)粒載體的原因，工程菌株的生長(zhǎng)狀況比野生型菌株稍弱。
　　另外，本研究還嘗試通過(guò)對(duì)xylAB操縱子的去調(diào)控，如敲除該操縱子阻遏蛋白XylR編碼基因xylR，以及用組成型啟動(dòng)子P43替換木糖異構(gòu)酶基因xylA的可