環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)檢測(cè)牛肉中大腸桿菌O157的研究.pdf

1、分類(lèi)號(hào)：!墨2Q2：壘密級(jí)：公玨單位代碼：學(xué)號(hào)：!鯉墨魚(yú)2鯉墨12l環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)檢測(cè)牛肉中大腸桿菌0157的研究StudyonaloopmediatedisothermalAmplification(LAMP)forthedetectionof‘?！痗herichiacoli0inbe；fleScherichiacoil0I57Inbeel學(xué)位申請(qǐng)人：梁磊指導(dǎo)教師：張偉教授學(xué)科專(zhuān)業(yè)：農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程學(xué)位類(lèi)別：農(nóng)學(xué)

2、碩士授予單位：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)答辯日期：二。一一年五月二十九日摘要1885年，德國(guó)科學(xué)家TEsch撕ch首次發(fā)現(xiàn)大腸桿菌0157：H7，它是引起腹瀉的重要致病菌。大多數(shù)食物中毒都可追溯到牛肉和未消毒的牛奶，而且感劑量小于100個(gè)細(xì)菌即可引起感染。目前對(duì)大腸桿菌0157：H7的檢測(cè)方法主要有傳統(tǒng)的常規(guī)培養(yǎng)法、免疫學(xué)檢測(cè)方法和以PCR為代表的分子生物學(xué)檢測(cè)方法。傳統(tǒng)方法操作繁瑣，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，而且靈敏度較低；免疫學(xué)檢測(cè)方法特異性和靈敏度不理想；P

3、CR方法敏感、快速，但由于需要昂貴的儀器設(shè)備、繁瑣的電泳過(guò)程，難以在基層普及和推廣。采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loopmediatedisothermalamplification，LAMP)技術(shù)，檢測(cè)食品中的大腸桿菌0157：H7，具有靈敏度高，特異性強(qiáng)，檢測(cè)方法簡(jiǎn)便，耗時(shí)短，檢測(cè)成本低等特點(diǎn)，適宜在基層普及和推廣。本研究針對(duì)大腸桿菌0157：H7(IQCC10102)帕E保守序歹lJ(Genbank$83460)，運(yùn)用在線引物設(shè)計(jì)軟件(h

4、ttp：／／primerexplorerjp／e／indexhtml)設(shè)計(jì)LAMP引物。對(duì)BST酶添加量、dNTP濃度、鎂離子濃度等擴(kuò)增條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定25“L的LAMP反應(yīng)體系為：內(nèi)引物(FIP和BIP)各16IxM，外引物(F3和B3)各02laM，環(huán)引物(LB)O8laM，06mMdNTP，30mMMgCl2，10BstDNA聚合酶反應(yīng)緩沖液，8UBstDNA聚合酶大片段，1肛LDNA模板和滅菌雙蒸水。LAMP反應(yīng)過(guò)程是：64

5、℃水浴鍋中反應(yīng)20min，然后將其放入80℃水浴鍋中，水浴10min終止反應(yīng)，通過(guò)肉眼觀察有無(wú)白色焦磷酸鎂沉淀，判斷是否發(fā)生LAMP反應(yīng)。為了比較LAMP檢測(cè)大腸桿菌0157：H7靈敏度和人工污染的檢出限，以PCR方法作對(duì)照。PCR引物是LAMP的兩條外引物(F3和B3)。結(jié)果表明：LAMP檢測(cè)大腸桿菌0157：H7的靈敏度為98CFU／mL，人工污染牛肉的檢出限為68CFU／g。PCR檢測(cè)大腸桿菌0157：H7的靈敏度為980CFU／

6、mL，人工污染牛肉的檢出限為68x103CFU／g。采用試劑盒法提取DNA，從樣品處理到報(bào)告結(jié)果，LAMP方法約耗時(shí)2h，PCR方法約耗時(shí)3h。利用LAMP方法對(duì)19株腸道致病菌進(jìn)行特異性試驗(yàn)。結(jié)果表明：三株大腸桿菌0157為陽(yáng)性，其他16株菌均為陰性。初步研究了3種模板制備方法對(duì)LAMP檢測(cè)牛肉中大腸桿菌0157：H7的影響。結(jié)果表明，LAMP方法對(duì)制備模板DNA的要求不高。研究表明：LAMP技術(shù)是一種檢測(cè)程序簡(jiǎn)單、靈敏度和特異性較高