重組右旋糖酐蔗糖表達條件優(yōu)化及其制備右旋糖酐與果糖的應用研究.pdf

1、右旋糖酐蔗糖酶(簡稱DSR,EC2.4.1.5)是一種由腸膜狀明串珠菌產生的葡萄糖基轉移酶,該酶的催化是以蔗糖為底物,將蔗糖分子中的D.葡萄糖基催化轉移形成D-glucosyl-dextransucrase,并釋放出果糖,其結果生成右旋糖酐和果糖兩種重要物質。右旋糖酐是具有很大價值的精細化學藥品,可以作為代用血漿、藥物載體以及葡聚糖凝膠,同時還可以被應用于改良食品工業(yè)上的一些食品,比如牛奶和乳酸飲料。果糖是一種左旋性的六碳糖,進入人體后

2、可與腸粘膜上皮細胞載體蛋白結合吸收進入人體內,在肝、腎、小腸中與特異性果糖激酶作用參與體內代謝。歐、美、日均已將果糖列入藥典,將其作為口服劑或注射劑使用,特別是給糖尿病人進行使用。本實驗在已經完成重組大腸桿菌高效表達重組右旋糖酐蔗糖酶優(yōu)化研究的基礎上,進行以蔗糖為底物,在重組右旋糖酐蔗糖酶的催化下制備右旋糖酐和果糖的應用研究。
　　 本研究首先對重組右旋糖酐蔗糖酶高效表達過程進行優(yōu)化,優(yōu)化的過程主要是從節(jié)約制酶成本的角度來考慮。

3、將發(fā)酵培養(yǎng)基中的胰蛋白胨以及酵母浸膏替換為蛋白胨與部分無機鹽,從而達到培養(yǎng)基優(yōu)化的目的。經研究發(fā)現,將胰蛋白胨以及酵母浸膏替換為蛋白胨與硝酸鉀,所得酶活表達能力達到143.71U/ml,是相同條件下原培養(yǎng)基的93.23％,滿足實驗中催化所需要的酶活力,可以用來替代原培養(yǎng)基。考慮到IPTG的成本較高且具有毒性,而單獨使用乳糖誘導物又無法使酶得到高效表達,本實驗對重組右旋糖酐蔗糖酶表達過程中的誘導物進行了研究。將IPTG與乳糖進行聯(lián)合誘導重

4、組右旋糖酐蔗糖酶的生成,研究發(fā)現,將兩者進行聯(lián)合使用,IPTG與乳糖的含量分別為0.095mmol/L與2.5g/L的時候,所得到的重組右旋糖酐蔗糖酶酶活表達能力達到161.76U/ml,滿足實驗中所需要的酶活力。其次考察了酶活力與底物加入量對制備右旋糖酐的影響,得到的實驗結果為:當酶活力大于160U/ml以上時,100ml14％的蔗糖溶液中需要加入的酶液量為1ml;當酶活力在125U/ml-160U/ml之間時,100ml14％的蔗糖

5、溶液中需要加入的酶液量為3ml;當酶活力在90U/ml-125U/ml之間時,100ml14％的蔗糖溶液中需要加入的酶液量為5ml;當酶活力在70U/ml以下時,則對整個過程有影響,即便加入10ml酶液,效果也不是很理想。酶活力的提高會降低酶液的加入量,有助于在催化制備右旋糖酐過程中節(jié)約酶成本。
　　 最后對催化產物果糖的回收與結晶過程進行了研究。根據文獻報道,果糖在水溶液中的直接結晶方法并不可取,因為果糖在水溶液中的溶解度很大

6、,很難進行結晶。考慮將果糖的水體系轉換成果糖一無水乙醇體系。將醇沉之后的果糖液進行旋蒸,制備成合適濃度的果糖溶液,經實驗探索,果糖濃度為230g/L時為最佳,在該濃度的果糖溶液中加入氧化鈣粉末將果糖轉化為果糖鈣固體,氧化鈣的加入量是通過果糖15055176838與氧化鈣反應的方程式確定的,含果糖量230g/L的溶液中加入的氧化鈣的量為96g/L,然后將果糖鈣加入到無水乙醇中,在無水乙醇中通過加入草酸將果糖鈣中的果糖置換出來,成功的將果糖