基于轉(zhuǎn)糖基功能的右旋糖酐蔗糖酶分子改造、表達(dá)及催化性能的研究.pdf

1、糖基轉(zhuǎn)移酶(Glycosyltransferase，GT,EC2.4.x.y)的轉(zhuǎn)糖基作用是催化葡萄糖基轉(zhuǎn)移到受體分子上，使受體分子糖基化，形成糖基化衍生物包括非天然糖類(lèi)化合物和功能性低聚糖等。非天然糖類(lèi)化合物可以改變?cè)瓉?lái)天然化合物的理化性質(zhì)，功能性低聚糖作為調(diào)節(jié)腸道平衡的雙歧因子應(yīng)用在醫(yī)藥、食品、保健品等領(lǐng)域。本論文通過(guò)分子學(xué)手段對(duì)右旋糖酐蔗糖酶(Dextransucrase，DSR)進(jìn)行改造，構(gòu)建篩選得到具較高活性的突出轉(zhuǎn)糖基的DS

2、R突變酶，揭示其轉(zhuǎn)糖基功能的關(guān)鍵區(qū)域;并對(duì)該突變酶的性質(zhì)進(jìn)行研究，同時(shí)利用改造后的轉(zhuǎn)糖基酶對(duì)不同糖類(lèi)受體和維生素C(VC)進(jìn)行糖基化，與原始酶進(jìn)行分析比較，獲得該突變酶對(duì)受體糖基化的催化規(guī)律。
　　首先通過(guò)分子截短方法，截短右旋糖蔗糖酶的C-端1494bp片段，得到剩余1-3087bp基因片段的DSR-S1-ΔA突變酶，并對(duì)突變酶的表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化。酶學(xué)性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn):該酶最適pH均為5.4，pH穩(wěn)定性均為4.4-7;最適溫度均為2

3、5℃;DSR-S1-ΔA酶在沒(méi)有受體情況下，酶活完全喪失;受體存在時(shí)，DSR-S1-ΔA酶活是原始酶酶活的71.4％，其中糖基轉(zhuǎn)移活性是水解活性的5.3倍，DSR-S1-ΔA耐熱性比原始酶有所下降，在30℃保藏1h酶活力只有20.8％。以麥芽糖為受體研究表明，受體濃度為200mM時(shí)酶活最高，供體蔗糖對(duì)DSR-S1-ΔA酶的影響較大，酶活隨著蔗糖濃度提高而不斷增加。結(jié)果顯示DSR-S1-ΔA主要活性為轉(zhuǎn)糖基功能，多糖聚合能力低，從而明確了

4、DSR的轉(zhuǎn)糖基功能區(qū)域。
　　通過(guò)對(duì)麥芽糖、纖維二糖、棉子糖和水蘇糖等不同糖類(lèi)受體的轉(zhuǎn)糖基研究，結(jié)果表明:麥芽糖是該酶轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)的最佳受體，同時(shí)對(duì)纖維二糖、棉子三糖和水蘇糖都有活性，但轉(zhuǎn)糖基依次減弱;不同天然低聚糖的轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)都趨向于生成低分子量的糖，轉(zhuǎn)移1-2個(gè)葡萄糖基到受體分子，并且受體分子量越小越易進(jìn)行轉(zhuǎn)糖基作用，α鍵連接糖類(lèi)化合物比β鍵連接糖類(lèi)化合物更易進(jìn)行轉(zhuǎn)糖基反應(yīng);說(shuō)明改造后的酶能利用更少的麥芽糖合成更多的低聚糖。論文